在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。

一、原理

用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

（一）材料：待測植物（水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。

（二）儀器設(shè)備：1. 722型分光光度計(jì)；2. 研缽；3. 100ml小燒杯；4. 容量瓶；5. 大試管；6. 普通試管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴鍋；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 濾紙；13 剪刀。

（三）試劑1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中；2. 3％磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸濃度的配制取6個(gè)50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）取6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。

（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。

（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520nm波長處進(jìn)行比色。

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 樣品的測定

（1）脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。

（2）吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。

（3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。

（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計(jì)上520nm波長處比色，求得吸光度值。

四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2ml測定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：

脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/樣重（g）。