實驗90 離子交換凝膠柱層析

原理

　　在植物生理生化的研究中，往往要從一個組分復雜的混合物中，將性質很相近的生物大分子分離，這是研究工作中一個很關鍵的問題，需要一種具有高度分辨力的技術，才能滿足這一要求。離子交換層析就是這樣的技術，能夠分離只有很小差異的物質（例如僅有一個氨基酸不同的兩種蛋白質），是分離生物大分子的一種重要方法。由于差不多所有的生物大分子都是極性分子，都帶有電荷。離子交換層析的基本原理即基于溶質分子所帶的電荷，能使所帶電荷稍有不同的分子分離。

　　進行離子交換層析的過程有兩個主要階段：第一階段是加樣和產生吸附作用過程，未被吸附的物質則從柱床上流失；第二階段是物質從柱子上洗脫，彼此得到分離。發(fā)生分離作用是由于不同物質所帶電荷不同，對離子交換劑有著不同的親和力，親和力的大小可以通過改變條件而加以調節(jié)，如通過改變離子強度和pH。

制備層析柱

　　1．選擇離子交換劑

　　離子交換劑的種類很多，根據交換劑的功能基團可分為陽離子交換劑和陰離子交換劑，陽離子交換劑又分強酸型（如乙基磺酸，SE；丙基磺酸，SP），弱酸型（如羧甲基，CM）。用離子交換劑也有強堿型[二乙基—（2—羥丙基）氨基乙基，QAE]，弱堿型（二乙基氨基乙基，DEAE）。由于交換劑的母體（matrix）不同，又有樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等類型。沒有一種交換劑對所有物質的分離都是適用的，所以工作開始首先要選定交換劑的類型。要選擇交換劑首先應根據分離物質的性質，例如要分離純化酶，酶是一種蛋白質，蛋白質為兩性物質，由于外界環(huán)境的pH不同，所帶的電荷也不同。當pH值低于等電點時，蛋白質帶正電荷，能結合在陽離子交換劑上，此時應選用陽離子交換劑；pH高于等電點時，帶負電荷，無疑應選用陰離子交換劑。此外，還應考慮蛋白質的變性、酶的失活等，如果該酶在低pH時不穩(wěn)定，這樣就只能在高于等電點的PH條件下，選用陰離子交換劑進行分離，而不能在低于等電點的PH條件下，用陽離子交換劑進行分離。一般情況下分離的起始緩沖液的PH值總是高于或低于等電點1pH單位（此時應高于等電點1pH）。如果要分離的酶的等電點在文獻上查不到，則可以通過簡單的試驗，確定起始緩沖液的pH值，其方法為：

　　(1)取試管數支，每管中加入0.1g葡聚糖凝膠離子交換劑（或其他類型離子交換劑）。

　　(2)各管用0.5mol/L緩沖液10ml使吸脹，然后用緩沖液洗10次，每次10ml，如為陰離子交換劑則所用緩沖液的pH范圍為5─9，陽離子交換劑則用pH4─8，pH間距為0.5。

　　(3)用離子強度較低（0.01─0.05mol/L）pH值相同的緩沖液洗各管中的交換劑凝膠5次，每次10ml，使交換劑平衡穩(wěn)定。

　　(4)在每管中加入一定量的樣品（如要純化的酶液），搖動試管5─15分鐘，放置待膠粒下沉。

　　(5)取每管中的上清液進行分析（測定酶活性）。假如出現圖40所示結果，在pH6.0─6.5之間酶蛋白被交換劑結合，這種情況下，起始緩沖液的pH應選用6.5，在該pH下被結合的蛋白質更容易從交換劑上釋放，如果選用更高的pH，會給以后從交換劑上洗脫帶來困難。

　　此外，還應該考慮交換劑的顆粒大小以及它的硬度，這些都會影響洗脫液的流速。交換劑的孔度雖然不會影響交換的機理，但因位于交換劑內部的功能基團，對大分子物質來說就無法利用，這樣就會影響交換容量。另外，還應考慮樣品的分子量，如分子量小于106 ，可選用SephadexC─25或A—25；分子量在104 ─105 之間，則可選用SephadexC—50或A—50，或Sepharose（瓊脂糖凝膠）、Sephacel（微晶纖維素）；分子量大于105 ，選用Sepharose或Sephacel都是合適的；對于很大的分子，如分子量超過4×104 ，可用SephadexC—25或A—25，因為它們的微珠最小，在膠粒的表面，可取代的功能基團最多，有利于大分子物質在膠粒表面發(fā)生離子的交換。

　　2．選擇緩沖系統(tǒng)

　　對于一個緩沖系統(tǒng)來說要考慮的是緩沖成分、離子強度及pH值。如果緩沖離子帶的電荷與交換劑功能基團的電荷相反，它們將參與離子交換過程，使局部的pH發(fā)生變化。所以陰離子交換劑要用陽離子緩沖液（如Tris、吡啶、咪唑、銨、乙二胺、烷基胺、氨基乙醇等緩沖液）；陽離子交換劑則用陰離子緩沖液（如醋酸、檸檬酸、甘氨酸、磷酸以及巴比妥等緩沖液）。緩沖液的離子強度影響結合能力，離子強度低時對交換劑功能基團的競爭結合能力弱，所以蛋白質與交換劑的結合較強，增加離子強度則增加競爭作用，降低了交換劑與蛋白質的結合能力，結果將蛋白質從交換劑上洗脫。洗脫液的離子強度也可以通過試驗確定（與上述選擇起始緩沖液pH值的試驗相似，用選定的起始緩沖液pH，以2 梍5×10-1 1mol/L NaCl進行測定）。當離子強度為0.1，pH處于等電點±0.5時，則該物質開始從離子交換劑上解離。

　　3．裝柱、洗脫分離

　　層析柱的質量直接影響分離的效果，質量差的柱子會降低分辨能力，使峰變寬，流速不穩(wěn)。在裝柱過程中應特別注意不能有氣泡進入，產生死體積，以避免已分離的組分重新混合。所以吸脹后的交換劑和配好的緩沖液，應該用真空泵抽除空氣。交換劑凝膠用起始緩沖液充分吸脹（吸脹1梍2天），如果交換劑凝膠是瑞典Pharmacia Fine Chemicals產品，直接用緩沖液吸脹即可。如果不是鹽式劑型則需要事先用酸和堿作預處理，處理時避免劇烈攪動。柱子裝好后至少要用2倍柱床體積的緩沖液流過交換劑，使達到平衡和穩(wěn)定。樣品中離子的組成應該與起始緩沖液相同，如果不同，可以通過在起始緩沖液中透析使其達到一致。如果以后用起始緩沖液洗脫，則加在柱上的樣品量一般為柱床體積的1梍5%。如果用梯度溶液洗脫，則應使樣品的重要組分，在柱子頂端被吸附，這時樣品中組分的含量較樣品的體積更為重要，大體積的稀樣品不必經過濃縮就可以直接加到柱子上。

　　在通常情況下可用常液洗脫（即用起始緩沖液洗脫），這是最簡單而方便的洗脫方式，不需要梯度儀，但分離的時間長些，分離效果也較差。目前用得更多的是濃度梯度洗脫，在洗脫過程中改變離子強度。前面已經提到過，增加離子強度則增加與交換劑上功能基團的競爭作用，降低了交換劑與樣品組分的結合能力，結果將組分從交換劑上洗脫，濃度梯度洗脫方式可以提高分離的效果，也可縮短分離的時間。提高離子強度通過梯度裝置（儀）連續(xù)不斷地在緩沖液中加入濃度較大的NaCl來實現。用部分收集器將分離后的不同組分，分別收集在試管中，然后測定（如測定蛋白質含量或酶活性等）各試管中存在的各個組分。層析裝置如圖41所示。

　　4．層析柱的再生

　　經過層析分離后往往會有一些雜質污染交換劑凝膠或柱床的表面，必須處理除去。上樣前應將樣品離心或過濾，除去樣品中的不溶物，以免污染柱床表面。對于已沉積于柱床表面的不溶物，可人工挖去表層交換劑，再適當補充一些新的。蛋白質、脂類等對交換劑的污染，可分別用0.1mol/L NaOH和1mol/L NaCl洗滌，再用蒸餾水洗至中性，然后用緩沖液平衡。洗滌過程一般可在層析柱中進行。暫時不用的交換劑，加緩沖液制成懸液，加入防腐劑，如0.02%疊氮鈉、0.001%醋酸苯汞等，在冰箱中可貯藏一年左右。如用過的交換劑數量較大，則可進行干燥后保存。