凝血實驗的標準化問題
摘要 對ICSH、ICTH或美國國家臨床生物化學(xué)委員會（NCCLS）等國際以文件形式公布的有關(guān)凝血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）和纖維蛋白原測定等三項實驗的標準化及其重要性作了簡單敘述。
關(guān)鍵詞： 凝血酶原時間 活化的部分凝血活酶時間 纖維蛋白原 標準化
由于血栓與止血實驗的特殊性，因此迄今僅有凝血酶原時間（prothrombin
time,PT）、活化的部分凝血酶時間（activated partial thromboplastin
time,APTT）和纖維蛋白原（fibrinogen,Fg）等三項實驗有了標準化的試劑（如PT）、標準品（如Fg）、質(zhì)控品和統(tǒng)一的報告形式等；其他，如血小板功能、抗凝因子和纖溶成分等檢測尚缺乏成熟的標準化方案。
本文僅就經(jīng)國際血液學(xué)標準化委員會（ICSH）國際血栓與止血委員會（ICTH）或美國國家臨床生物化學(xué)標準委員會（NCCLS）等國際組織以文件形式公布的有關(guān)PT、APTT和Fg三項實驗的標準化問題作一簡介。
一、標準化和質(zhì)量控制的重要性
所謂血栓與止血檢測方法的標準化和質(zhì)量控制，是指采用統(tǒng)計學(xué)原理，運用規(guī)范的物理、化學(xué)、生物學(xué)的方法，對血栓與止血實驗的技術(shù)、操作、儀器、試劑和標本等項的質(zhì)量水平，進行合理的管理、檢測和評價，以標準化和質(zhì)量控制來堵絕誤差，提高實驗的精密度、準確性和可靠性。標準化和質(zhì)量控制的重要性在于
1.為臨床診治提供可靠的依據(jù)：實驗結(jié)果的可靠性是臨床診治疾病的重要依據(jù)和條件。實驗結(jié)果若為假陽性就會造成誤診、誤治；若為假陰性就會造成漏診、漏治；實驗結(jié)果偏高或偏低都會影響患者的診斷、鑒別診斷以及影響醫(yī)師對病情和療效的判斷。
2.提高血栓與止血基礎(chǔ)研究的效率和價值：血栓與止血基礎(chǔ)研究的形式就是進行各種實驗。實驗可靠性好，就能揭示血栓與止血的客觀規(guī)律，甚至可帶來重大理論突破及（或）社會、經(jīng)濟效益；若實驗可靠性差或有錯誤，則會造成假象或錯誤理論。
3. 有助于人群健康調(diào)查和建立血液學(xué)參數(shù)的正常范圍：為了解一定人群的健康水平，建立具有廣泛意義的血液學(xué)參考值的范圍須進行較大規(guī)模人群的健康調(diào)查，健康調(diào)查必須要有實驗結(jié)果的可靠性作保障，不然會導(dǎo)致不準確或錯誤的結(jié)果，故質(zhì)量控制對群體醫(yī)學(xué)也有重要意義。
總之，血栓與止血實驗室的質(zhì)量控制，從一定程度上反映一個國家，一個地區(qū)，一個單位血栓與止血醫(yī)療水平和研究水平的高低。因此，應(yīng)倍加重視。
二、 凝血酶原時間（PT）的標準化
自1935年Quick創(chuàng)建凝血酶原時間（prothrombin
time,PT）測定方法以來，迄今仍然
是檢查外源凝血系統(tǒng)諸因子及相關(guān)抑制物的重要篩選試驗，PT也是目前口服抗凝劑治療的主要手段。但是，PT測定受多種因素影響，必須對它進行標準化和質(zhì)量控制，以提高PT檢測的精密度、準確度和可靠性。
（一）凝血酶原時間（PT）的標準化問題
1.組織凝血活酶標準化：應(yīng)用的國際參考品（international reference preparation IRP），有下列幾種：
（1）單一組織凝血活酶國際參考品：是一種組織提取物的生理鹽水懸液制劑。WHO在英國使用的統(tǒng)一標準的“英國比較凝血活酶”（British
comparative thromboplastin,BCT）為基礎(chǔ)，制備WHO的原級凝血活酶參考品（primary reference
preparation），如人腦組織凝血活酶，編號67/40。同時又以BCT67/40為基礎(chǔ)標化了次級參考品（secondary
reference preparation）。
如牛腦組織凝血活酶，編號為68/434；兔腦為70/178。后來WHO還公布了一些次級組織凝血活酶參考品，如人腦或胎盤制劑，如BCT/253；兔或兔、猴組織混合制劑，如RBT/79等。
（2）復(fù)合組織凝血活酶國際參考品：它是組織提取物的生理鹽水懸液中加入適量的纖維蛋白原、因子V 和氯化鈣組成的制劑，如牛組織凝血活酶OBT/79等。
目前世界各國都廣泛應(yīng)用WHO的這些參考品來校正本國或本地區(qū)制備或生產(chǎn)的組織凝血活酶參考物。這樣使世界范圍內(nèi)有了多種組織凝血活酶參考品。
2.組織凝血活酶工作制劑（working preparation,WP）的國際敏感度指數(shù)
（international
sensitivity
index,ISI）由于不同組織凝血活酶對凝血因子的敏感性不同。為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測PT中能得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個共同的敏感性指標。這就需要通過自制的試劑與國際參考品（IRP）進行比較，然后得出一個校正值。具體的方法如下：
（1）用國際參考品（IRP）標定國家、地區(qū)或本實驗室的參考制劑（reference preparation,RP）。
（2）用實驗室參考制劑（RP）標定工作制劑（WP）。
1）標本：2份正常人血漿和6份口服抗凝劑達6周的患者血漿，連收10天，共60份標本。
2）測定：按一定順序進行測定，每份標本重復(fù)測定2次。將PT測定的結(jié)果（秒）點在雙 對數(shù)坐標紙上，橫坐標代表WP的PT測定結(jié)果，縱坐標代表RP的PT測定結(jié)果，畫出最佳的各點擬合直線，得出定標曲線，通過WP/RP比值，或回歸方程求出斜率b。
3）計算WP的ISI值：
ISI值愈接近于1.0，表明組織凝血活酶試劑愈敏感，因此，生產(chǎn)和出售組織凝血活酶試劑的廠商，必須在產(chǎn)品上標有ISI。
3.PT測定結(jié)果的報告方式：理論上，無論何種組織凝血活酶，只要標有ISI，就可與國際參考制品進行對比校正，并可用同一種計量單位報告。1985年ICSH和ICTH推薦以PT監(jiān)測口服抗凝劑的報告方式是國際正?；嚷剩╥nternational
normalizde ratio,INR）。INR的計算公式如下：
在用INR后，各種敏感性不同的組織凝血活酶均可得到相同的INR值。
4.儀器特有有ISI：上述PT根據(jù)報告方式適用于手工法（試管傾斜法）測定PT。但是手工法與儀器法以及儀器法與儀器法測定PT的INR之間，仍有差異。研究表明，在ACL、Cobas
Fibro和Coaga-Pet三臺自動化儀器上，使用同一種ISI為1.12的Thromborel
S試劑，測定PT的均值分別為10.7秒、12.1秒和11.1秒。
但若以同一ISI值計算INR，得出的數(shù)值也存在著不同程度的差異。為此，專家們提出建議：同一組織凝血活酶試劑用于不同儀器時，可用所謂的“儀器特有的ISI”（instrument specific ISIs）或稱區(qū)域性ISI（Local ISI）來計算INR。
每臺儀器所使用的凝血活酶試劑都應(yīng)該有特定的ISI值，重新標定ISI值的做法是購買標有INR的凍干血漿，然后在自己的儀器上再標定所使用凝血活酶試劑的ISI值，這樣才可使病人的INR具有可比性。
（二）凝血酶原時間（PT）的推薦方法
[原理]
將組織凝血活酶（主要含組織因子和脂質(zhì)）和鈣離子，加到枸櫞酸抗凝血漿中，在37℃保溫，測定血漿凝固時間，即為PT。PT主要用于篩選檢測外源凝血系統(tǒng)的因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ和相關(guān)因子的抑制物的試驗。
[標本來集和處理]
1.標本采集：用硅化或塑料注射器抽取空腹靜脈血，按9:1比例加入含0.109mol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑的硅化或塑料試管中，輕輕混合均勻。
2.標本處理：以2000～2500g，離心15分鐘，分離乏血小板血漿，并在24小時內(nèi)完成試驗。
3.正常對照血漿：選擇正常健康男性和女性各lO名以上，年齡在18～45歲。但不能是妊娠、月經(jīng)期、哺乳期和口服避孕藥的婦女，采取的血漿冰凍干燥保存或-80℃保存。
[試劑]
1.抗凝劑：109mmol/L枸櫞酸鈉液（相當于含二分子結(jié)晶水的枸櫞酸鈉32g/L）。
2.凝血活酶試劑：市售商品，應(yīng)標有ISI、批號及有效期。凍干者應(yīng)按說明書加指定的緩沖稀釋劑復(fù)溶。
3.氯化鈣（CaCl2）溶液：為25mmol/L。（目前有些商品試劑已將凝血活酶液與氯化鈣液混合好，可不必另配CaCl2液）。
4.質(zhì)控物：正常及異常對照血漿
5.配制試劑用水必須符合1級純水的標準。
[儀器]
1.手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒溫水浴箱或電熱塊。水深能浸試管3cm以上，表面無劃痕的10×mm拭管。經(jīng)標準的0.1mL移液管。經(jīng)校正的秒表。
2.儀器法：各種自動或半自動血凝儀，嚴格按說明書操作。
[操作步驟]
1.手工法
（1）測定溫度36.5～38.5℃，上述各試劑及被測血漿，均應(yīng)預(yù)溫至此一溫度，但凝血活酶試劑預(yù)溫不可超過30分鐘，血漿預(yù)溫一般不宜超過10分鐘。
（2）所用試管及加樣器等接觸血漿的器具均為塑料或硅化玻璃管。
（3）吸取枸櫞酸抗凝血漿0.1mL，加入一小試管中：加入凝血活酶試劑0.1mL混勻后置37℃水浴中。再加入25mmol/L CaCl2液0.1mL，（也可先將凝血活酶試劑與CaCl2溶液等量混合，加入0.2mL）。
立即混勻并開動秒表：試管仍浸于水浴中，至約10秒鐘時，自水浴中取出，在紗布上迅速擦去試管外水滴，在明亮處不斷傾斜試管，在流動狀態(tài)下觀察有無纖維蛋白形成。一旦見到纖維蛋白（同時將出現(xiàn)液體流動減慢），立即停表，記錄時間。
每次測定二管，按平均數(shù)報告。本試驗的最后混合液其pH應(yīng)為7.2～7.3，大部分商品凝血活酶試劑均用含緩沖液的溶液配制。
（4）每批均同時做正常和異常對照，方法應(yīng)與測定標本完全相同。
[報告方式]
1.以PT的秒（S）數(shù)報告（最接近的0.5秒）
2.以患者血漿（S）/正常對照PT（S）的比率（PRT）報告。
3.在口服華法令類抗凝藥物治療監(jiān)控時，應(yīng)報告國際正?；嚷剩↖NR）。大部分自動化儀器可根據(jù)所測的PTR和凝血活酶試劑的ISI，自動算出INR。手工法可根據(jù)下列公式，用一計算器直接計算：
Poller設(shè)計了一個簡便的列線圖，在取得PTR和ISI值后，即可從圖上直接查找出INR值，十分便利，國內(nèi)已有介紹。
ICSH規(guī)定，不再用稀釋曲線或百分比（活動度）報告。
[參考值]
因儀器/試劑不同，會得出不同結(jié)果，故很難統(tǒng)一規(guī)定參考值。各實驗室應(yīng)根據(jù)自己的儀器、試劑等條件，自行測定一批健康人，建立參考值。此后至少每年或當條件有變化時，根據(jù)新的條件，重新建立。
參考值PT測定的一切條件均應(yīng)與患者血漿PT測定相同（包括采血、容器、抗凝劑等）。健康供血者應(yīng)選至少20個18～55歲的男性和非妊娠、月經(jīng)期女性，不可服藥，在平靜休息狀態(tài)采血、以減少個體差異（有條件時，可測一批老年人和小兒，分開統(tǒng)計）。
同時應(yīng)分開幾天采血和測定，以減少天間差異。測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，計算標準差：以兩個標準差（2SD）或95%可信限作為參考范圍。
對于三個標準差是正常還是異常，需結(jié)合具體情況進行評估。從統(tǒng)計學(xué)上講，其中有些人是正常的。用以上標準，病人（PT異常）則很少會遺漏。
三、活化部分凝血活酶時間(APTT)的標準化
（一）活化部分凝血活酶時間(APTT)的標準化
APTT是檢測內(nèi)源凝血系統(tǒng)諸凝血因子缺陷和相關(guān)抑制物的篩選試驗，也是當前用于凝血因子、肝素抗凝治療以及狼瘡抗凝物質(zhì)檢測的主要手段。
與PT測定一樣，不同的部分凝血活酶、不同的活化劑和不同的激活時間對各種凝血因子缺陷、對肝素和對狼瘡抗凝物質(zhì)的敏感性相差很大。例如，檢測APTT的試劑中，所用活化劑（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他們對檢測肝素、狼瘡抗凝物質(zhì)和因子Ⅷ、Ⅸ的敏感性不同。
迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT檢測方法標準化或試劑標準化的可行方案問世，僅NCCLS于1992年，提出一個編號為H29-T的暫行方案。
（二）活化的部分凝血活酶時間（APTT）的推薦方法
[原理]
將一種磷脂和激活劑加到血漿中，經(jīng)過孵育后，加入適當濃度的鈣離子。其纖維蛋白凝塊形成的時間（以秒計），即為APTT。本法主要用于過篩測定內(nèi)源途徑凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ、激肽釋放酶原（PK）、高分子量激肽原（HMWK）以及纖維蛋白原等。同時也用于上述因子的抑制物測定、肝素治療的監(jiān)測以及狼瘡抗凝因子的檢查。
[儀器]
本實驗所用儀器、設(shè)備（包括采血、貯血容器、加樣裝置和標本的處理等）以及對它們的要求完全與PT相同。PT所用自動化儀器同樣適于本實驗。
[試劑]
1.部分凝血活酶試劑：由商品供應(yīng)。一般已與檄活劑按比例配在一起（或分開配制）常用的激活劑由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活劑，由廠方配套供應(yīng)。
APTT試劑/儀器結(jié)合，應(yīng)能使因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性低于0.3μ/mL（或＜30%）的血漿，出現(xiàn)異常延長的結(jié)果。
2.氯化鈣溶液（25mmol/L）以及其它試劑與PT所用者相同。
[操作步驟]
1.樣品的采取、貯存、輸送與PT測定相同。注意，應(yīng)用清潔的塑料或硅化玻璃采血器采血及貯血。
2.標本（去血小板的血漿）的制備與PT相同。注意、應(yīng)用去血小板血漿測定。
3.水浴箱或電熱板的溫度為37℃±1℃，要經(jīng)常檢查是否正確。
4.接觸活化時間：加激活劑活化因子Ⅻ的時間要保持一致；各儀器和試劑生產(chǎn)廠家的規(guī)定可能不一樣，應(yīng)嚴格按說明書要求進行。手工操作時，應(yīng)用秒表或類似的定時裝置計時。
5.操作：預(yù)溫（不超過30分鐘）APTT試劑一份與預(yù)溫（不超過10分鐘）的侍測血漿一份混合，立即開動秒表計時；至規(guī)定的接觸活化時間終點時，加人預(yù)溫37℃的CaCl2液一份，混勻，同時開動秒表。至出現(xiàn)血漿凝固時，停表，記錄血漿凝固時間（以秒計）。
手工測定時應(yīng)同時測定兩管，按平均數(shù)報告。一些精密度已有很大改進的自動或半自動凝血儀，如果有適當?shù)馁|(zhì)控標準也可只測定一次。應(yīng)同時測定正常和異常對照血漿。
[參考值]參照PT
[特殊解釋]
1.對肝素的敏感性：APTT常用于肝素治療的監(jiān)測，通常以患者APTT與正常血漿APTT的比率在1.5～2.5作為治療控制范圍：但不同的試劑/儀器系統(tǒng)對肝素的敏感性不同。其試劑/儀器系統(tǒng)對肝素的敏感性可進行測定。
體外的敏感性（in vitro sensitlvity）是指將臨床在使用的同類型釣肝素按其治療濃度，加到正常血漿中，測定APTT。體外敏感性與體內(nèi)敏感性（in vivo sensitivity）不等同，但可作參考。
2.浪瘡抗凝因子：狼瘡抗凝因子是一種抗磷脂的自身抗體，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干擾凝血。血中如存在狼瘡抗凝因子，APTT將延長。
但APTT試劑對狼瘡抗疑因子的敏感性有很大差別，試劑制造廠家應(yīng)提供足夠的說明，有關(guān)的國家機構(gòu)也可提供對狼瘡抗凝因子的資抖。但要知道，病人個體之間也有很大差異，沒有一種試劑能測出所有狼瘡抗凝因子。
四、纖維蛋白原測定（Fg）的標準化
（一）纖維蛋白原測定（Fg）的標準化問題
纖維蛋白原（死）由肝合成，存在于血漿和體液中，其結(jié)構(gòu)和功能基本已搞清，但迄今仍無理想的臨床檢測方法；文獻報道的測定方法多至10余種，有的精密度、準確信較好，但過于復(fù)雜、煩瑣；有的雖然簡便、快速，但精密度、準確性較差。
1992年，英國國家生物標準及控制研究所（NIBSC）、研究完成了一個纖維蛋白原標準品，編號為89/644，向WHO的生物標準專家委員會（ECBS）推薦，[15]并被ECBC批準為國際參考品（IRP）。
從此，各國均引進這一標準品來標化本國或廠家生產(chǎn)的次極標準品（我國衛(wèi)生部臨床檢驗中心亦已在引進）。使纖維蛋白原測定的標準化工作，走出了關(guān)鍵的一步。因此根據(jù)調(diào)查，各家標準品纖維蛋白原含量差別很大。
（二）纖維蛋白原（Fg）測定的推薦方法
各家用IRP來標化自己的標準時，推薦采用Jacobsson的改良法，現(xiàn)將該法介紹如下。
[試劑]
1.緩沖液：Na2O·2H2O 0.882g；KH2PO4 2.77gl升，此為貯存緩沖液；將貯存緩沖液l份，加生理鹽水2份即為應(yīng)用緩沖液，pH為6.35。
2.生理鹽水：0.15mol/L
3.人或牛凝血酶：500IU/mL，生理鹽水溶液。
4.凝塊溶解劑：尿素400g溶于少量蒸溜水中，200mL 1.Omol/L NaOH，再加水至l升。
[操作步驟]
將纖維蛋白原凍干（標準）品（源于89/644）加lmL蒸餾水復(fù)溶，加到含有2mL應(yīng)用緩沖液的有機玻璃淺盤或其他容器中，再加入凝血酶液50μL，迅速混勻，在室溫中靜制置2小時。將容器倒扣于吸水的布上（其下可墊吸水紙），再用適當物質(zhì)（加濾紙）將凝塊吸干。
將凝塊取下，置于5OmL生理鹽水中洗滌2次，每次洗滌后均應(yīng)將凝塊吸干（可用玻璃擠壓凝塊），盡量除去含于凝塊中的液體，以免液體中的其它血漿蛋白殘留。必要時可在清潔棉布上擠壓。
小心將凝塊加人含凝塊溶解劑7.5mL的容器中，搖勻，直至凝塊完全溶解。倒人光徑為1cm的比色杯中，以凝塊溶解劑為空白，在280nm和315nm波長讀取吸光度（A）。
[計算]
纖維蛋白原濃度（g/L）
式中15.87為纖維蛋白在堿性條件下波長280nm的消光系數(shù)；7.5為纖維蛋白原的稀釋倍數(shù)。
當A在1.0以下時，吸光度與濃度呈線性關(guān)系。如A大于1.0，應(yīng)稀釋標本重新測定，重新乘稀釋倍數(shù)
（三）適用的纖維蛋白原（Fg）測定（Clauss法）
[原理]
將凝血酶加到血漿中，使纖維蛋白原變成纖維蛋白，血漿便出現(xiàn)凝固。在有足量的凝血酶時，與不同含量的纖維蛋白原作用，其出現(xiàn)血漿凝固的時間與纖維蛋白原含量呈負相關(guān)。
[試劑]
1.牛凝血酶l00NIHU/mL
2.纖維蛋白原標準品（IRP次級標準）
3.緩沖液（下列兩種任選一種）：
（1）巴比妥緩沖液（PH7.5）；巴比妥2.5g，巴比妥鈉2.75g，璐氯化鈉7.3g溶于750mL去離子水中，校正至PH7.5，加水至1L。
（2）咪唑（Imidazole，或Glyoxaline）緩沖液：咪唑3.4g（0.05mol/L），氯化鈉5.85g，加于約500mL水中；加O.1mol/L鹽酸186mL，調(diào)PH至7.3-7.4，最后加蒸餾水至1升。
[操作步驟]
1.手工法
（1）用上述緩沖液先將標準品稀釋成0.8，1.6，2.4，和4.0g/L纖維蛋白原濃度，各濃度再用緩沖液作1:10稀釋。
（2）患者血漿及質(zhì)控物用緩沖液作1:10稀釋。
（3）將含100NIHU/mL，牛凝血酶，混勻后室溫保存。如用儀器法測定，則用100NIHU/mL，牛凝血酶，不必稀釋。
（4）在一試管中，加稀釋血漿0.2mL，置37℃水浴中4分鐘。
（5）加入預(yù)溫37℃的lOONIHU/mL凝血酶液O.2mL，搖勻并立即開動秒表，不斷觀察凝固時間。至出現(xiàn)凝固時停表。
（6）每份標本測定兩次，求平均數(shù)。同時測定各標準管和對照（質(zhì)控）管，方法相同，準確記錄時間。
（7）計算：用雙對數(shù)紙作圖，以凝固時間為縱坐際、纖維蛋白原濃度為橫坐標，將各相應(yīng)濃度的標準管對凝固時間，在圖上標出相應(yīng)的點并連成直線，制成標準曲線。然后根據(jù)患者和質(zhì)控血漿所測得的凝固時間。
如血漿纖維蛋白原含量大于4g/L，應(yīng)稀釋血漿后重測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如血漿纖維蛋白原含量低于O.8g/L，需將原血漿改為1:2或1:5稀釋，在標準曲線上查得結(jié)果后除以5或除以2。
2.儀器法：本法可用自動或半自動凝血儀按凝血酶時間（TT）測定法測定?？勺詣哟蛴〕鼋Y(jié)果。一般儀器法比手工法精密度高.
