促甲狀腺素化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒的研制
促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一種由垂體前葉分泌的糖蛋白激素, 由α和β2個(gè)亞基組成,? 相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為28000[1]。TSH本身受下丘腦分泌的TSH釋放激素TRH的調(diào)控, TSH的主要生理作用是調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成與分泌, 血液中甲狀腺激素水平與腺垂體分泌TSH的量之間有負(fù)反饋抑制關(guān)系[2]。甲狀腺功能改變時(shí), TSH的波動(dòng)較甲狀腺激素更迅速且明顯, 是反映下丘腦垂體甲狀腺軸功能的敏感指標(biāo), 因此采用靈敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意義。化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一種靈敏的免疫分析方法, 在免疫診斷試劑研制中已得到了廣泛的應(yīng)用[3]。本研究根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法的原理研制了血清TSH的檢測(cè)試劑盒, 與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品相比具有簡(jiǎn)便、 快捷、 成本低等優(yōu)點(diǎn)。
1? 材料和方法
1.1? 材料? TSH單克隆抗體(mAb)、 TSH標(biāo)準(zhǔn)品抗原和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）為Sigma公司產(chǎn)品, 光免板為T(mén)hermo Electron公司產(chǎn)品, 化學(xué)發(fā)光底物為BioRad公司產(chǎn)品。
1.2? 方法
1.2.1? 標(biāo)準(zhǔn)品的配制? 將TSH抗原標(biāo)定后溶于小牛血清中, 配制成含0.1, 1, 5, 20, 100 mIU/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2.2? 抗體包被板的制備? 將100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸鹽緩沖液加至包被板中, 37℃包被2 h, 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液于37℃封閉2 h后晾干備用。
1.2.3? 酶標(biāo)記物的制備? TSH的酶標(biāo)記物采用過(guò)碘酸鈉法制備, 然后經(jīng)0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜后, 加入等量的甘油于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4? 檢測(cè)方法? 將50 μL待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入包被TSH的光免板中, 37℃溫育30 min, 棄反應(yīng)液, 用洗滌液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液）洗5次, 加酶標(biāo)記物50 μL, 37℃溫育30 min后同樣用洗滌液洗5次, 然后加入發(fā)光底物于5～10 min內(nèi)測(cè)定各孔的發(fā)光值RLU。樣本中的TSH濃度依據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)品TSH濃度和對(duì)應(yīng)的RLU建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量。
2? 結(jié)果
2.1? 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)? 在HRP魯米諾H2O2發(fā)光體系中, 將不同量的免疫復(fù)合物加入發(fā)光液中, 發(fā)光強(qiáng)度（RLU）隨反應(yīng)時(shí)間而變化。10 min后RLU接近峰值, 在5～15 min內(nèi)RLU較為穩(wěn)定, 隨后開(kāi)始緩慢下降。
2.2? 反應(yīng)條件優(yōu)化
2.2.1? 加樣量對(duì)RLU的影響? 樣本和酶標(biāo)記物的加樣量分別為50 μL和100 μL考查標(biāo)準(zhǔn)品（0、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L）RLU, 發(fā)現(xiàn)加樣量為100 μL與50 μL RLU相差不大, 說(shuō)明50 μL的加樣量反應(yīng)能達(dá)到平衡(圖1)。
圖1? 加樣量對(duì)RLU的影響（略）
2.2.2? 反應(yīng)模式對(duì)RLU的影響? 采用二步法。第一步: 加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品后, 將反應(yīng)體系在37℃分別溫育15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶標(biāo)記抗體后, 將反應(yīng)體系在37℃分別溫育15、 30、 45、 60 min。結(jié)果表明溫育時(shí)間為30 min時(shí)反應(yīng)皆能達(dá)到平衡(圖2)。
圖2? 溫育時(shí)間對(duì)RLU的影響（略）
A: 第一步溫育時(shí)間對(duì)RLU的影響; B: 第二步溫育時(shí)間對(duì)RLU的影響.
2.3? 穩(wěn)定性? 將試劑盒放置于37℃ 6 d后, 比較與放置前參考標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)RLU值, 參考標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)RLU值未見(jiàn)明顯降低, 且本底發(fā)光值無(wú)明顯升高, 表明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)明顯漂移, 滿足穩(wěn)定性要求。
2.4? 方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.4.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度? 在設(shè)定的免疫反應(yīng)和發(fā)光條件下, 以標(biāo)準(zhǔn)血清的濃度（0～100 mIU/L）制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。同時(shí)測(cè)定20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn), 用零標(biāo)準(zhǔn)均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差, 計(jì)算出此方法的靈敏度為0.0788 mIU/L。
圖3? TSH標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）
2.4.2? 精密度? 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/
