| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
高嚴格性洗滌緩沖液（0.2XSSC，5 g/LSDS），預熱到 68°C(可選，見第 9 步）
低嚴格性洗滌緩沖液（2XSSC，5 g/LSDS)，預熱到 68°C(可選，見第 9 步）
SDS，5 g/L(可選，見第 9 步）
SSC，20X（1L 配方：175.3 gNaCl 和 88.2 g 檸檬酸鈉,pH7.0)
2. 核酸和寡核苷酸
Blocking 溶液 [含有 2 mg/ml 未純化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物（使用 cDNA 的情況下），以及它們的互補寡核苷酸]
經(jīng)過剪切的鮭魚精 DNA（10 mg/ml)
3. 探針
純化的檢測者和驅動者探針，隨機引物法標記（每 100ng 消減 DNA 至少 107cpm)(可選，見第 9 步）
4. 專用設備
沸水浴
雜交爐，預熱至 72°C
5. 附加試劑
ExpressHyb Hybridization Kit(Clontech)
放射自顯影所需的試劑與設備
二、方法
1. 使用商業(yè)試劑盒，用隨機引物法標記驅動和檢測 DNA 探針。這里所給的雜交條件是根據(jù) Cbntech 的 ExpressHyb 溶液來優(yōu)化的；對于其他系統(tǒng)，應該根據(jù)經(jīng)驗來確定最佳雜交條件。
2. 為每張膜配制足夠體積的預雜交溶液。
a. 混合下列溶液：5ul 20XSSC，5ul 經(jīng)過剪切的鮭魚精 DNA(10 mg/ml) 和10ul 阻斷溶液 [含有 2 mg/ml 未純化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物（使用 cDNA 的情況下），以及它們的互補寡核苷酸]。
b. 將阻斷溶液煮沸 5 min, 然后在冰上冷卻。
c. 將阻斷溶液與 5 ml ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech) 混合。
3. 將每張旗放到第 2 步配制的預雜交液中，72°C 振蕩條件下預雜交 40~60 min。
在預雜交液中加入阻斷溶液是很重要的，因為消減探針與所分析的克隆具有相同的接頭序列，不管其內部序列如何, 這些探針都能同所有克隆雜交。
4. 制備雜交探針。
a. 混合下列溶液：50ul 20XSSC,50ul 經(jīng)過剪切的鮭魚精 DNA(10 mg/ml),10ul 阻斷溶液，以及純化的探針（每 100ng 消減 DNA 至少 107cpm)。確保每種探針的特異活性都大致相等。
b. 將探針煮沸 5 min，然后在冰上冷卻。
c. 將探針加到預雜交液中。
5.72°C 振蕩雜交過夜。
6. 配制低嚴格性（2XSSC,5 g/LSDS) 和高嚴格性（0.2XSSC,5 g/LSDS) 洗滌緩沖液，并加熱到 68°C。
7. 依次用低嚴格性緩沖液（4X20 min，68°C) 和高嚴格性緩沖液（2X20 min，68°C)洗膜。
8. 進行放射性自顯影。
9. 如果需要，在 5 g/LSDS 中煮沸 7 min, 可以除去探針。
印跡一般可以重復使用至少 5 次。
為了將雜交背景降到最低，不使用時應將旗放在 SaranWrap 中，-20°C 保存。
? ? ? ? ? ? 展開 |
