方法一速測卡法(紙片法)

　　2.1范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由酶抑制法測定蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速篩選測定。

　　2.2原理

　　膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯(紅色)水解為乙酸與靛酚(藍(lán)色)，有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。

　　2.3試劑

　　2.3.1固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片(速測卡)。

　　2.3.2 pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉[Na2HPO4·12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2 PO4 ]，用500mL蒸餾水溶解。

　　2.4儀器

　　2.4.1常量天平

　　2.4.2有條件時配備專為速測卡而設(shè)計的“農(nóng)藥殘留速測儀”和超聲波提取器。

　　2.5分析步驟

　　2.5.1表面測定法(粗篩法)：擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。放置10分鐘進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，將速測卡對折(紅色藥片與白色藥片疊合)后，用手捏3分鐘時，打開與空白對照實驗卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對照卡相同，為陰性結(jié)果。有條件時，將紙片插入“農(nóng)藥殘留速測儀”自動恒溫、定時檢測。

　　2.5.2整體測定法：選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL浸提液(樣品與浸提液的比例為1﹕2)，震搖50次(有條件時，可將提取瓶放入超聲波提取器中震蕩30秒)，靜置2分鐘以上。取一片速測卡，在白色藥片上滴上2～3滴提取液，放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，以下操作和觀察結(jié)果與5.1法相同。有條件時，將紙片插入“農(nóng)藥殘留速測儀”自動恒溫、定時觀察。

　　2.6干擾物質(zhì)與排除方法：目前國內(nèi)外所使用的農(nóng)藥殘留測定方法(紙片法和分光光度法)的檢驗原理基本相同，測定中的干擾物質(zhì)也基本相同。蔥、蒜、蘿卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，不要剪的太碎。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也不要剪的太碎。

　　2.7使用注意事項：當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，速測卡加液后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以空白對照卡用(體溫)手指捏3分鐘時可以變藍(lán)，即可往下操作。樣品放置的時間應(yīng)與空白對照卡放置的時間一致才有可比性。紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)的時間以3分鐘為準(zhǔn)，3分鐘后的藍(lán)色會逐漸加深，24小時后顏色會逐漸退去?？瞻讓φ湛ú蛔兩脑颍皇撬幤砻娼嵋杭拥纳?、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。

　　2.8速測卡法的檢出限與符合率：表1是由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、廣東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、香港政府化驗所、廣東省農(nóng)藥檢定所、深圳市衛(wèi)生防疫站、華南農(nóng)大昆蟲毒理研究室七個單位，使用速測卡法，對我國常見使用的一些有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢出限的實驗與驗證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計表

　　表1常見農(nóng)藥的檢出限與國家允許蔬菜中最大殘留限量(mg/kg)

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　　在使用速測卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽性時，即可視為有機磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥已超標(biāo)。有條件時，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對陽性試樣進(jìn)行進(jìn)一步的實驗來確定是哪種農(nóng)藥、確切含量。

　　方法二酶抑制率法(分光光度法)

　　2.9原理

　　在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物(乙酰膽堿)水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。

　　2.10試劑

　　2.10.1 pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。

　　2.10.2顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4°C冰箱中保存。

　　2.10.3底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。

　　2.10.4乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3分鐘的吸光度變化DA0值應(yīng)控制在0. 3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。

　　2.10.5可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的DA0值應(yīng)控制在0. 3以上。

　　2.11儀器

　　2.11.1分光光度計或相應(yīng)測定儀

　　2.11.2常量天平

　　2.12分析步驟

　　2.12.1樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1~2分鐘，倒出提取液，靜置3~5分鐘，待用。

　　2.12.2對照溶液測試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37°C放置15分鐘以上。加入0.lmL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄初始吸光度A1和反應(yīng)3 min時的吸光度A2，A2-A1=DA0。

　　2.12.3樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄初始吸光度A1和反應(yīng)3 min時的吸光度A2，A2-A1=DAt。

　　2.13結(jié)果的表述計算

　　2.13.1結(jié)果計算

　　檢測結(jié)果按公式計算：抑制率(%)=[ (DA0-DAt)/ DA0]×100

　　式中：DA0——對照溶液反應(yīng)3分鐘吸光度的變化值；

　　DAt——樣品溶液反應(yīng)3分鐘吸光度的變化值；

　　2.13.2結(jié)果判定

　　結(jié)果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。

　　當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時，表示蔬菜中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。

　　對陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。

　　2.14附則

　　2.14.1酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)

　　2.14.1.1靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限見表2。

　　表2酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限(mg/kg)

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　　2.14.1.2符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。

　　2.15說明

　　2.15.1干擾物資與排除方法與方法一(紙片法)相同。

　　2.15.2當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3分鐘的吸光度變化DA0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時間應(yīng)與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3分鐘的吸光度變化DA0值＜0.3的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。

　　2.15.3當(dāng)吸光度大到無法讀取時，說明測定液渾濁有干擾。

　　2.15.4在氣相色譜分析儀還未問世及分布較少時，對有機磷類農(nóng)藥的檢測即采取了酶抑制分光光度法，只是由于當(dāng)時酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進(jìn)一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長。由于這兩個現(xiàn)實情況，在實驗前，必需測試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進(jìn)行。