對(duì)于Western Blotting實(shí)驗(yàn)而言,樣品處理是關(guān)鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質(zhì)、可溶,并解離成單個(gè)多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴(lài)本身的分子量大小進(jìn)行分離。

當(dāng)目標(biāo)蛋白的含量很低時(shí),需要選取目標(biāo)蛋白含量較高的組織或細(xì)胞器(如核抽提物),或者通過(guò)免疫沉淀等方式進(jìn)行富集。通常樣品有重組蛋白、細(xì)胞和組織等。

1. 樣品收集

1)培養(yǎng)的細(xì)胞

貼壁和懸浮細(xì)胞收集方式不同,細(xì)胞裂解液種類(lèi)各異,推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解,煮沸即可。

2)動(dòng)物組織

與細(xì)胞不同,組織塊由于體積較大,須預(yù)先經(jīng)破碎勻漿處理。

2.樣品定量

樣品電泳前需測(cè)定蛋白濃度,以便保證上樣量一致,有利于后續(xù)定量或半定量分析。常用的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法有好多種,其靈敏度和所需時(shí)間不同,且不同的方法會(huì)受不同干擾物質(zhì)的影響,實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)樣品制備方法(裂解液成分、去垢劑和還原劑種類(lèi)等)自行選擇。

幾種蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法比較

注意事項(xiàng):

a. 應(yīng)盡量避免引入影響后續(xù)定量的雜蛋白(如細(xì)胞培養(yǎng)液、蛋白酶抑制劑等)及其他干擾物質(zhì);

b. 樣品濃度應(yīng)適中,1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量:貼壁細(xì)胞按10 cm2培養(yǎng)皿/0.1 ml,懸浮細(xì)胞按5×106細(xì)胞/0.1 ml比例加入;

c. SDS對(duì)蛋白質(zhì)變性和電泳分離至關(guān)重要,濃度應(yīng)控制在2-10% 之間,并根據(jù)具體需要調(diào)整;

d. 制備好的樣品可以在-20℃ 保存,但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),并避免反復(fù)凍融,否則蛋白會(huì)發(fā)生降解;

e. 內(nèi)參對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要,應(yīng)選擇合適的內(nèi)參。