概述熒光定量PCR技術(shù)的原理
又稱實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)有兩個(gè)熒光基團(tuán)的熒光雙標(biāo)記探針，一個(gè)標(biāo)記在探針的5′端稱為報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)；另一個(gè)標(biāo)記在探針的3′端稱為熒光抑制基團(tuán)或稱淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)。兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5′端R發(fā)出的熒光信號(hào)可被3′端R基團(tuán)抑制。3′端的-OH已被封閉，不具有延伸的能力。探針引物在無特異性PCR擴(kuò)增時(shí)，熒光信號(hào)不改變。在PCR反應(yīng)開始后，隨著鏈的延長，熒光定量PCR的Taq酶沿著DNA模板移動(dòng)到熒光標(biāo)記探針的結(jié)合部位，發(fā)揮它的5′-3′外切酶活性，將熒光探針切斷。一但切斷，Q基團(tuán)的抑制作用消失，從而引起R基團(tuán)的熒光信號(hào)增長，被釋放的游離R基團(tuán)的數(shù)目和PCR產(chǎn)物的數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系，因此R基團(tuán)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比關(guān)系。測(cè)定出前者就可以推算出后者。這就是熒光定量PCR的原理。在PCR的過程中，連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)的變化，當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值時(shí)(根據(jù)熒光信號(hào)基線的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即閾值)，此時(shí)循環(huán)次數(shù)(ct)就被記錄下來，該循環(huán)參數(shù)和PCR體系中起始DNA量的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的ct值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的ct值就可以準(zhǔn)確定出起始DNA的拷貝數(shù)。
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焦點(diǎn)事件
