Western Blotting技術(shù)已經(jīng)問世四十多年了，依然是蛋白分析中最常用和主流的方法。但近些年Western Blotting數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，穩(wěn)定性，定量準確性等問題，也使這項技術(shù)被推到了風口浪尖，同時也有很多文章因為Western Blotting數(shù)據(jù)的問題而撤稿，而為了盡可能提高Western Blottig數(shù)據(jù)的可靠性和準確性，期刊雜志對于接收涉及Western Blotting技術(shù)數(shù)據(jù)的文章也提出了新的要求。

　　接下來我們看看都要哪些要求：

　　1.不建議跑平行膠，因為平行膠和剝離膜孵育體系，操作條件的不一致，影響定量的準確性，因此最好內(nèi)參和目的蛋白要在同一張印跡膜上

　　2.選擇寬態(tài)范圍的方法，確認信號強度與所上樣量之間的線性關(guān)系，例如用膠片做化學發(fā)光方法的動態(tài)范圍就很窄，不建議使用：

　　數(shù)字成像相比膠片動態(tài)范圍更寬、定量更準確

　　3.強烈推薦使用總蛋白進行歸一化，因為看家蛋白容易受處理條件影響而發(fā)生變化，影響定量的結(jié)果，使用總蛋白定量更真實地反映目標蛋白表達量的變化

　　4.提交原始數(shù)據(jù)，例如：JBC，PLOS和CELL等雜志都要求要提供原始數(shù)據(jù)

　　聊完了期刊雜志的一些要求，那Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)是如何幫助您獲得滿足期刊雜志W(wǎng)estern Blotting要求的數(shù)據(jù)：

　　★ Sapphire是多熒光檢測系統(tǒng)，可多達4個激光光源，同時進行4通道熒光檢測，獲得更快的工作流程和更可靠的定量數(shù)據(jù)

　　熒光Western Blotting使用熒光基團標記的二抗進行檢測，膜上的靶標蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關(guān)系，實現(xiàn)真實可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現(xiàn)多個蛋白檢測。這樣目標蛋白和內(nèi)參蛋白在同一張膜上，就可以避免數(shù)據(jù)造假的情況發(fā)生，更容易被期刊雜志接收。

　　圖1：通過使用四種光譜不同熒光基團標記的二抗，可以同時檢測多達四種不同的蛋白。HeLa細胞裂解物上樣，anti-tubulin (550nm, 綠色), anti -actin (700nm紅色), anti-GAPDH (800nm, 灰色),和anti-transferrin (490nm, 藍色)這四種蛋白同時成像，沒有交叉。

　　★ Sapphire配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個靶標蛋白，生成可以信賴的定量Western Blotting數(shù)據(jù)

　　使用總蛋白歸一化，以校正泳道和樣品之間的差異。傳統(tǒng)的方法無法準確知道條帶灰度值和強度的變化是由于樣品的生物學變化引起的，還是由于上樣或樣品的不一致性或樣品制備的差異引起的?？偟鞍讱w一化優(yōu)勢如下：

　　? 總蛋白比看家基因等內(nèi)參的線性檢測范圍更寬。

　　? 在整個實驗和系統(tǒng)中更加穩(wěn)定。

　　? 能有效排除實驗條件和體系對結(jié)果的影響。

　　? 更真實地反映目標蛋白表達量的變化。

　　圖2.總蛋白歸一化和定量三個靶標蛋白. Tubulin 紅色通道, Actin 藍色通道,GAPDH綠色通道, AzureRed/total protein 用灰色表示

　　圖3.使用總蛋白對Tubulin信號進行歸一化，糾正上樣誤差

　　★ Sapphire配有獨特的三種檢測器設計，最大限度地提高儀器的檢測動態(tài)范圍，保證結(jié)果的準確性

　　PMT檢測器用于藍光檢測和磷屏成像。

　　APD檢測器用于NIR，紅色和綠色熒光的檢測。

　　CCD檢測器用于高靈敏化學發(fā)光的檢測。

　?。?ZL技術(shù)）

　　★ Sapphire提供原始數(shù)據(jù)16bit的tiff圖給到期刊，這里的tiff原始數(shù)據(jù)是指未經(jīng)裁剪，像素修改，對比度調(diào)整等任何操作的圖，保證結(jié)果的真實性和可靠性

　　Sapphire除了進行熒光印跡膜，化學發(fā)光印跡膜檢測外，還可以進行In cell western孔板成像、In-Gel膠，2D和2D DIGE、切片掃描、組織成像和動植物成像、同位素標記樣品磷屏成像等。