蛋白質(zhì)含量的測定—Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍(lán)法

1.學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

2. 進(jìn)一步掌握分光光度法——求標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確測定未知樣品、正確使用儀器。

?

原理

?

蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸收等測定而得知：或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚試劑反應(yīng)等方法來求算。其中雙縮脲法和Folin-酚法是一般實驗室中經(jīng)常使用的方法。它們操縱簡便、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，又能適合一般實驗室的要求，若作一般的濃度測定較為適應(yīng)。Folin-酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。本實驗采用的是Folin-酚法。

Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成。試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng)。試劑乙（磷鎢酸和磷鉬酸混合液）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸，故有此顏色反應(yīng)。因此，用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度較高。

實驗步驟

?

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按下表操作

?

?

2. 樣品（小白菜）液的提取

稱取小白菜1-4克（菜桿2-4克，菜葉1-2克）置于研缽中，加 5mL蒸餾水在低溫下研磨成勻漿，全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽濾，在3000rpm離心20分鐘，上層清液為提取液，待用。

<!--[if !supportLists]-->3. <!--[endif]-->樣品的測定

吸取提取液和稀釋250倍的血清液各1.0mL于試管中（三次重復(fù)），分別加5.0mL試劑甲，放置10分鐘后，加試劑乙0.5mL，立即混勻，恒溫37度反應(yīng)20分鐘，測A₇₅₀的值。

?

?

?

?

☆ 小白菜用mg／g， 血清用mg／mL。

?

二 考馬斯亮藍(lán)法（1976年）

?

原理

?

染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收波長的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了測定蛋白質(zhì)的靈敏度（1ug）

實驗步驟

?

1.求標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：按下表配置，操作。

?

?

?

?

2. 樣品pr.含量的測定

吸取小白菜提取液0.5mL，加入 蒸餾水0.5mL（三次重復(fù)）；吸取血清（稀釋500倍）1.0mL（三次重復(fù)），向以上各管加入考馬斯亮藍(lán)G-250 5.0mL，室溫放置5分鐘，測A₅₉₅的值（一小時內(nèi)完成）。

?

?

?

?

☆ 小白菜用mg／g，血清用mg／mL。

?

要求r≥0.99