微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然香蘭素工藝分享
香蘭素，又名香草素、香草醛或香蘭醛，化合物名稱為4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，化學(xué)物質(zhì)登記號121-33-5。香蘭素是香子蘭制品中的重要組成成分，作為一種廣譜型高檔香料，廣泛應(yīng)用于食品、煙草及醫(yī)藥工業(yè)。香蘭素的世界年消費量約1.2萬噸，而天然香蘭素的產(chǎn)量僅為1800噸，因此遠不能滿足需求。由于人們對天然品需求愿望的增強及生產(chǎn)天然香蘭素巨大的商業(yè)利益，天然香蘭素的獲取已成為近年來的研究熱點。
根據(jù)FDA規(guī)定，只要原料是天然的，通過生物催化法(酶作用)獲得的香料就是天然的。香蘭素的生物合成方法主要有微生物發(fā)酵、酶工程、細胞工程等。但是綜合考慮技術(shù)可行性、經(jīng)濟性、安全性等因素，微生物發(fā)酵法被認為是目前最實際的天然香蘭素制取方法。許多細菌和真菌都可用來生產(chǎn)香蘭素，這些微生物以阿魏酸、丁子香酚、異丁子香酚、香草醇等化合物為前體，發(fā)酵獲得香蘭素。作者對世界各國微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然香蘭素工藝進行了文獻調(diào)研，現(xiàn)將有關(guān)的工藝方法及其效果介紹如下。首先關(guān)注德國、法國、瑞士三個國家在這方面的研究進展。
（一）德國
2003年德國Muenster大學(xué)Overhage, Joerg等人以重組的大腸桿菌E. coli XL1-Blue(pSKvaomPcalAmcalB)將丁子香酚轉(zhuǎn)化成阿魏酸，30-L規(guī)模生物轉(zhuǎn)化，總發(fā)酵30小時后，阿魏酸的最大濃度為14.7 g/L，摩爾產(chǎn)率93.3%（以丁子香酚計）。然后加入大腸桿菌E. coli(pSKechE/Hfcs)，使阿魏酸轉(zhuǎn)化成香蘭素(J. Overhage, H. Priefert, and A. Steinbuechel, Appl. Environ. Microbiol. 65:4837-4847, 1999)，香蘭素產(chǎn)率為0.3 g/L。
2000年德國Muenster大學(xué)Achterholt, S.等人對無枝酸菌HR 167的基因進行了研究，這個菌株含有烯酰CoA水解酶/醛縮酶(ech)，和feruloyl-CoA合成酶(fcs)。將這個基因片斷放在 4000bp PstI片斷(P40)上。再在大腸桿菌中表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組后的大腸桿菌降解阿魏酸的途徑與螢光假單孢桿菌AN 103和假單孢桿菌HR199相似。這說明無枝酸菌HR 167也具有將阿魏酸轉(zhuǎn)化成香蘭素的特性。無枝酸菌HR 167的代謝途徑如下：阿魏酸→阿魏?！鶦oA→4-羥基，3-甲氧基丙酶-CoA→香蘭素→香蘭酸。
1999年德國哈爾曼及賴默股份有限公司申請的中國專利CN99812907.0揭示了一種轉(zhuǎn)化的和/或誘變的單細胞或多細胞生物，其特征在于丁子香酚和/或阿魏酸分解代謝的酶被滅活，使得中間產(chǎn)物松柏醇，松柏醛，阿魏酸，香草醛和/或香草酸積累。
1996年德國哈爾曼及賴默股份有限公司申請的美國專利US6133003利用土壤絲菌DSM 9992菌株將阿魏酸轉(zhuǎn)化成香蘭素，32小時后，產(chǎn)量達11.5g/L，理論轉(zhuǎn)化率為77.8％。
（二）法國
絲狀真菌黑曲霉(Aspergillus niger)利用阿魏酸為前體物質(zhì)將其轉(zhuǎn)化為香蘭酸，朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)再將香蘭酸轉(zhuǎn)化為香蘭素，此法稱為兩步法。1999年法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（INRA）Bonnin, Estelle等人利用甜菜作為阿魏酸產(chǎn)生的原料，利用甜菜渣子作為纖維二糖產(chǎn)生的原料，使產(chǎn)量比沒有加入纖維二糖的培養(yǎng)基產(chǎn)量提高3.3倍 (764mg/L)，而同時用工業(yè)纖維二糖作為催化劑可比沒有加入纖維二糖的培養(yǎng)基提高3.1倍(725mg／L)。
1999年法國Oddou, J.等人單獨利用朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)作為出發(fā)菌株，并利用不同的碳源選擇它的高密度培養(yǎng)基，以阿魏酸為前體物質(zhì)代謝產(chǎn)生香蘭素。結(jié)果:得到菌株體的生物量對于產(chǎn)量有著至關(guān)重要的影響，以葡萄糖和磷脂混合作為碳源得到的菌絲體的生物量最高，相應(yīng)的產(chǎn)量最大，達到760mg／L。
（三）瑞士
1999年瑞士Givaudan Roure Research Ltd.的Muheim, A等人利用西唐氏鏈霉菌(Streptomyces setonii)，以阿魏酸代替有毒的丁香酸作為前體物質(zhì)產(chǎn)生了香蘭素。具體生產(chǎn)步驟如下：西唐氏鏈霉菌在基本培養(yǎng)中搖床培養(yǎng)→16h以后加入阿魏酸繼續(xù)培養(yǎng)→離心收集菌體→破壁→提取酶→加入阿魏酸反應(yīng)→處理培養(yǎng)基樣品→HPLC法測定樣品中的香蘭素的含量。搖瓶試驗結(jié)果表明西唐氏鏈霉菌可以產(chǎn)生 6.4g/L的香蘭素，摩爾產(chǎn)率為68％。
參考文獻
1.Overhage, Joerg; Steinbuechel, Alexander; etc. Highly efficient biotransformation of eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in recombinant strains of Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 69(11), 6569-6576,2003
2.Achterholt, S.; Priefert, H.;etc. Identification of Amycolatopsis sp. strain HR167 genes, involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 54(6), 799-807 ,2000
3.哈爾曼及賴默股份有限公司. 經(jīng)過特異性滅活丁子香酚和阿魏酸分解代謝的基因構(gòu)建制備取代酚的生產(chǎn)菌株. CN99812907.0（申請日1999.10.20公開日2001.12.05）
HAARMANN & REIMER GMBH (DE). Process for the preparation of vanillin and microorganisms suitable therefore. US6133003（申請日1996.08.23，授權(quán)公開日2000.10.17）
4.Bonnin, Estelle; Lesage-Meessen,etc. Enhanced bioconversion of vanillic acid into vanillin by the use of "natural" cellobiose. Journal of the Science of Food and Agriculture, 79(3), 484-486 (English) 1999
5.Oddou, J.; Stentelaire, C.; etc. Improvement of ferulic acid bioconversion into vanillin by use of high-density cultures of Pycnoporus cinnabarinus. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(1), 1-6 , 1999
6.Muheim, A.; Lerch, K. Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(4), 456-461 , 1999
《世界各國微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然香蘭素工藝導(dǎo)讀（上）》一文關(guān)注了德國、法國、瑞士三個國家在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然香蘭素方面的研究進展，本文繼續(xù)關(guān)注中國、日本和美國在該領(lǐng)域的研究。
（四）中國
2005年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)張莉力等人對朱紅秘孔菌的生長和香蘭素的生成兩個階段分別采用高密度培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基進行培養(yǎng)發(fā)酵，并通過對香蘭素生成階段的發(fā)酵條件的優(yōu)化后，可生成0．403g／L的香蘭素，相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為28．8％。
2004年陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院周慶禮等人研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸是生產(chǎn)香蘭素的較佳底物，添加量可達每升數(shù)克。發(fā)酵至16h后添加阿魏酸，此時鏈霉菌L1936對阿魏酸的轉(zhuǎn)化能力最強。此株鏈霉菌不僅能耐受高濃度的香蘭素，而且具有一種與其他菌株完全不同的代謝流。在轉(zhuǎn)化阿魏酸時，當(dāng)香草酸的積累量達到200mg／L時，就開始積累香蘭素作為代謝的主要過量合成產(chǎn)物。流加2次底物阿魏酸使之濃度達13g／L，產(chǎn)物濃度達到7．12g／L。相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為69．9％。
2003年天津科技大學(xué)申請的中國專利CN200310123675.7揭示了一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于：以谷糠、麥麩、甜菜渣等富含阿魏酸的農(nóng)副產(chǎn)品為原料，或以天然阿魏酸、姜黃素、(異)丁子香酚、4- 甲基愈創(chuàng)木酚為原料，微生物過量轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素，包括發(fā)酵工藝以及香蘭素的分離提取技術(shù)。
（五）日本
1992年日本TAKASAGO PERFUMERY CO LTD申請的日本專利JP 5227980以丁子香酚為底物，用假單胞菌(Pseudomonas spp TK2102)生產(chǎn)香蘭素。香蘭素在發(fā)酵液中累積可達280 mg／L，其他代謝產(chǎn)物是松柏醇、松柏醛、阿魏酸和香草醇。
1996年日本Mercian Corp.申請的日本專利JP 09224653通過紫外照射得到Saccharomyces cerevisiae酵母突變體，能夠高產(chǎn)香蘭素。
（六）美國
1991年美國GEN FOODS INC公司申請的美國專利US 5128253在含有葡萄糖的Mandels培養(yǎng)基中培養(yǎng)惡臭假單胞菌ATCC 55180過夜、收集，于0.2vols.Mandels培養(yǎng)基中再懸浮，Mandels培養(yǎng)基中包含5 mM二硫蘇糖醇，于室溫下培養(yǎng)。3小時后香蘭素的濃度達到31.97mg/L，1296小時后達到210mg/L。
參考文獻
7.張莉力. 遲玉杰微生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的研究. 現(xiàn)代食品科技.2005,21(2).-47-49
8.周慶禮. 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素食品與發(fā)酵工業(yè). 2004,30(3).-18-20
9.天津科技大學(xué). 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素. CN200310123675.7（申請日2003.12.18公開日2005.06.22）
10.TAKASAGO PERFUMERY CO LTD. Prepn. of vanillin, coniferyl-alcohol and -aldehyde, ferulic acid and vanilyl alcohol - by culturing mutant belonging to Pseudomonas genus in presence of eugenol which is oxidatively decomposed. JP 5227980（申請日19920221，公開日19930907）
11.Mercian Corp. Vanillin-high yeast mutant preparation. JP 09224653（申請日1996.2.26，授權(quán)公開日1997.9.2）
12.GEN FOODS INC (US). Bioconversion process for the production of vanillin. US 5128253（申請日1991.5.31，授權(quán)公開日1992.07.07）
