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miRNA qPCR Detection Primer Set（miRNA檢測(cè)試劑盒）實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

2020.7.13

一、概述

1、介紹
microRNA(miRNA)是一類有大約22 個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA 在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期及不同組織中有不同的表達(dá)模式，都表明了其在發(fā)育和分化中起有重大的調(diào)控作用。迄今為此，對(duì)miRNA 的檢測(cè)方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時(shí)長(zhǎng)、RNA 的用量較大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了國(guó)際上公認(rèn)的核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)――Real-Time PCR 技術(shù)來(lái)對(duì)miRNA 進(jìn)行檢測(cè)，其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

2、實(shí)驗(yàn)原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，以及qPCR正、反向引物套裝。其中莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)狀的miRNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物可特異性的轉(zhuǎn)錄成熟的miRNA。再利用高度特異的正反向引物，使miRNA定量即靈敏又高度特異。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一種最低能檢測(cè)到5個(gè)拷貝目標(biāo)miRNA的高靈敏度的檢測(cè)方法，并且具有一個(gè)7 個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)變化范圍，反應(yīng)的模板可以是總RNA或者已純化的小RNA等。

3、產(chǎn)品內(nèi)容

?名稱	?介紹	?量
RT Primer	?miRNA Reverse Transcription Primer	2 nmol
Forward??Primer	?miRNA Forward Primer	2 nmol
Revers Primer	?Universal Reverse Primer	2 nmol

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、客戶需自己提供實(shí)驗(yàn)試劑
一步法或兩步法qPCR mix，反轉(zhuǎn)錄酶，RNA 酶抑制劑，DEPC-H2O 等

2、耗材準(zhǔn)備
無(wú)RNase，DNase 的吸頭，離心管等

3、引物準(zhǔn)備
引物為干粉形式，需先離心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
釋至10μM，混勻后于-20oC凍存?zhèn)溆?/p>

4、儀器準(zhǔn)備
離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀等

三、實(shí)驗(yàn)步驟
1．兩步法擴(kuò)增
先將miRNA做反轉(zhuǎn)錄miRNA cDNA，然后再進(jìn)行qPCR定量

1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同時(shí)檢測(cè)50個(gè)以內(nèi)的miRNA分子。反轉(zhuǎn)錄之前，需預(yù)先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做內(nèi)參對(duì)照，需同時(shí)配置Random Primer或內(nèi)參的Reverse Prime做反轉(zhuǎn)錄引物。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄體系

試劑	體積	終濃度
RNA模板	0.2ng~1μg	根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求
RT Primer Mix	5 μl	20nM
10×RT Buffer	5 μl	1×
RNase inhibitor	見(jiàn)試劑供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)
dNTP (2.5mM)	4 μl	200nM
逆轉(zhuǎn)錄酶	見(jiàn)試劑供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)
DEPC-H2O	補(bǔ)足至50μl