T/NAASS 057-2023
牛4型皰疹病毒間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 抗體檢測技術(shù)規(guī)程

Technical specification for detection of indirect ELISA antibodies to bovine herpesvirus type 4

標準號

T/NAASS 057-2023

發(fā)布

2023年

發(fā)布單位

中國團體標準

當前最新

T/NAASS 057-2023

 

 

適用范圍

3　術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本文件。 牛4型皰疹病毒Bovine herpesvirus 4，BoHV-4 牛4型皰疹病毒屬于皰疹病毒科丙型皰疹病毒亞科猴病毒屬，是導(dǎo)致牛生殖障礙的主要病毒之一。 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗Indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA 間接ELISA方法是先將抗原結(jié)合到ELISA板上，隨后分兩步進行檢測，首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色,由呈色反應(yīng)來測定抗原。 4　間接酶聯(lián)免疫吸附試驗操作 試驗準備 實驗環(huán)境、儀器與設(shè)備、洗液的制備、稀釋液的制備、示蹤劑工作液的配制按照試劑盒說明書規(guī)定執(zhí)行。實驗環(huán)境的生物安全條件應(yīng)符合GB/T 19489的要求，稀釋用蒸餾水應(yīng)符合GB/T 6682的要求。 檢測樣品 新鮮或冷凍的血清、血漿、奶樣均可直接用于檢測。 奶樣準備：4000rpm/min離心20 min，利用巴斯德吸管吸取中間層液體，注意不要接觸到下層的細胞沉淀物。未稀釋的脫脂奶可直接加入微孔板。 操作程序 使用前將所有試劑恢復(fù)至21 ℃±3 ℃，輕輕搖動或旋轉(zhuǎn)，使試劑混合均勻。 4.3.1　準備 取出微孔板，并在操作記錄表上標記樣品的位置。如果使用微孔板的一部分，則只需取出足夠檢測樣品的條數(shù)。未使用的微孔板條用錫箔紙包好，保持干燥與密封，2 ℃～8 ℃保存。 4.3.2　血清或血漿稀釋 血清或血漿按試劑盒要求稀釋，避免使用溶血樣品和具有凝結(jié)物的樣品。在試劑盒的微孔板中按要求加入樣品、稀釋液，吹打混勻。 4.3.3　對照樣品（陽性血清和陰性血清）和示蹤劑稀釋 陽性血清、陰性血清及示蹤劑應(yīng)用稀釋液按試劑盒要求進行稀釋。 4.3.4　加樣 每孔加入樣品（血清、血漿或奶樣），一孔一樣。陽性血清加入A1孔，陰性血清加入A2孔，示蹤劑加入A3孔，樣品1加入A4孔，以此類推。 4.3.5　感作 將微孔板封板后，按照試劑盒說明書中指定的時間進行室溫孵育。 4.3.6　洗滌 棄去微孔板中液體，用300 μL左右的洗滌液洗滌每個板孔3次。在每一次洗滌后，甩去每個板孔中的液體，在洗滌時以及在加入下一步試劑之前要防止反應(yīng)板出現(xiàn)干燥現(xiàn)象，避免孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液體。 4.3.7　稀釋酶結(jié)合物 將酶結(jié)合物用稀釋液按要求進行稀釋。 4.3.8　加酶結(jié)合物 每孔加入酶結(jié)合物，搖勻。將微孔板封板后，按照試劑盒說明書中指定的時間進行室溫孵育，按步驟4.3.6進行洗滌。 4.3.9　加底物 每孔加入底物溶液。按照試劑盒說明書中指定的時間進行室溫孵育。 4.3.10　加終止液 每孔加終止液終止反應(yīng)。 4.3.11　測定吸光值（OD值） 酶標儀預(yù)熱15 min，在加入終止液5 min內(nèi)讀取試劑盒說明書中指定波長的吸光度值。 實驗有效性檢測 只有當滿足試劑盒說明書規(guī)定的條件時檢測才有效。 結(jié)果計算 使用試劑盒說明書指定的計算公式進行結(jié)果計算。 結(jié)果判定 使用試劑盒說明書規(guī)定的判定標準進行結(jié)果判定。

專題

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