原理

葉綠素a、b在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，可用以下聯(lián)立方程求葉綠素溶液中的葉綠素a、b的含量。

D663=82.04Ca9.27Cb……………………(1) D645=16.75Ca45.6Cb……………………(2) 式中D663、D664分別為波長(zhǎng)663nm和645nm處測(cè)定葉綠素溶液的光密度；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(g/L)；82.04、9.27分別為葉綠素a、b在波長(zhǎng)663nm時(shí)的比吸收系數(shù)，16.75、46.6分別為葉綠素a、b在波長(zhǎng)645nm時(shí)的比吸收系數(shù)。

解聯(lián)立方程(1)、(2)則得： Ca=0.0127D663-0.00269D645……………(3) Cb=0.0229D645-0.00468D663……………(4)

如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，(3)、(4)式則可改寫為： Ca(mg/L)=12.7D663-2.69D645…………(5) Cb(mg/L)=22.9D645-4.68D663…………(6) 葉綠素總量C(mg/L)=CaCb=20.2D6458.02D663……(7)

葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo) D652=34.5×C……………(8) 652nm為葉綠素a與b在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(diǎn)(等吸收點(diǎn))，34.5為葉綠素a、b在波長(zhǎng)652nm處的吸收系數(shù)。 DC=D652/34.5(g/L)Cd DC=D652×1000/34.5(mg/L)………(9)

因此，利用(5)、(6)式可分別計(jì)算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(9)式可計(jì)算葉綠素總量。

葉綠體色素的提取液中除含有葉綠素a與b外，還含有葉黃素和胡蘿卜素，因?yàn)槿~黃素和胡蘿卜素的吸收光譜均在藍(lán)光區(qū)，故不會(huì)干擾葉綠素含量在紅光區(qū)的分光光度法測(cè)定。

器材與試劑

722分光光度計(jì)，葉綠體色素提取所需器材。

方法與步驟

1. 提取葉綠素。

2. 測(cè)定光密度。

在1cm比色杯中，注入葉綠素提取液(濃度大時(shí)需稀釋)。另以葉綠素提取介質(zhì)作為參比溶液注入同樣的比色杯中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選用相應(yīng)的波長(zhǎng)(測(cè)總量選用652nm，測(cè)葉綠素a、b含量及總量選用663nm和645nm)，在分光光度計(jì)上測(cè)定光密度。

3. 計(jì)算結(jié)果：把測(cè)定的光密度代入上述公式可求出比色杯中的葉綠素含量。如要計(jì)算樣品中葉綠素含量時(shí)，需要考慮稀釋因子。

樣品中葉綠素含量(mgChl/g鮮重或mgChl/ml葉綠體)

D=比色杯中葉綠素含量×稀釋倍數(shù)/樣品量(g鮮重或ml葉綠體)

注意事項(xiàng)

用分光光度法測(cè)定物質(zhì)含量時(shí)，分光光度計(jì)的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)要準(zhǔn)確，參比杯與測(cè)定杯的透光率要一致。