western blotting的原理、操作步驟及意義
一。免疫印跡法
????免疫印跡法（immunoblotting?test，IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（enzyme?linked?immunoelectrotransfer?blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southen?blot相類似，亦被稱為Western?blot。免疫印跡（western?blotting）是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。典型的印跡實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)步驟①蛋白質(zhì)的電泳分離；②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域；③免疫學(xué)檢測(cè)。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學(xué)方法之一。
第一階段為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰膪凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分
離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已
經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min
轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。第三階段為酶免疫定位。將印
有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶
標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP
底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰
可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加人的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。本法綜合了
SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅
廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此
法作為確診試驗(yàn)?？乖?jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體
及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判
斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。
Westernblot?實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)?
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一.實(shí)驗(yàn)步驟?
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1.?組織塊稱重?
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2.?利用液氮、研缽粉碎組織塊?
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3.?加入RIPA緩沖液（每克組織3?ml?RIPA），PMSF（每克組織30μl，10?mg/ml?PMSF），利用Polytron進(jìn)一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃?
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4.?加入PMSF（每克組織30μl，10?mg/ml?PMSF），冰上孵育30分鐘?
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5.?移入離心管4℃?約20,000?g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘?
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6.?上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存?
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7.?進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度?
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8.?取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液?
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9.?沸水浴中3分鐘?
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10.?上樣?
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11.?電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）?
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12.?電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA?40分鐘）?
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13.?膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色?
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14.?Westernblot?試劑盒顯色?
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15.?分析比較記錄?
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western?blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料?
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1.?把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。?
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。?
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。?
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。?
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。?
5）按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。?
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。?
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2.?將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。?
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3.?用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。?
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4.?膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。?
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5.?室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。?
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6.?用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。?
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7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。?
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8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃過(guò)夜）?
9．用總體積300ml?PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜，每次75ml。?
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10.?將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升?NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。?
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11．按步驟9洗滌。?
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12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升?NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)。?
注意事項(xiàng)：?
western?blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western?blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western?blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。?
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Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。?
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1.收集蛋白樣品(Protein?sample?preparation)?
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐a(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞?
細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒?
進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。?
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要?
采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生?
產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。?
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2.?電泳(Electrophoresis)?
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(1)?SDS-PAGE凝膠配制?
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配?
膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。?
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(2)?樣品處理?
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋?
白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。?
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。?
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(3)?上樣與電泳?
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。?
為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。?
電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置?
或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，?
也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。為了電泳方便起見(jiàn)，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在?
100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90－120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)頭。?
通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適?
當(dāng)分離后即可停止電泳。?
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3.?轉(zhuǎn)膜(Transfer)?
我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過(guò)程中特別是用鑷子?
夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。?
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)?
夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，?
需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。?
在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。?
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春?
紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋?
白的殘留情況。?
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4.?封閉(Blocking)?
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步?
驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。?
用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以在?
4℃?封閉過(guò)夜。在整個(gè)Western過(guò)程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋?
白膜。?
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5.?一抗孵育(Primary?antibody?incubation)?
參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。?
用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果?
不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。?
回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌?
3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。?
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6.?二抗孵育(Secondary?antibody?inucubation)?
參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。?
用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。?
回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌?
3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。?
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7.?蛋白檢測(cè)(Detection?of?proteins)?
參考相關(guān)說(shuō)明書(shū)，使用BeyoECL,?Western?熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。?
洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。?
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8.?膜的重復(fù)利用(Membrane?recovery)?
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。
