凝血實(shí)驗(yàn)規(guī)范化問題的探討
凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（Fbg）和凝血酶時(shí)間（TT）是凝血機(jī)能障礙和抗凝治療檢測時(shí)的常規(guī)過篩性試驗(yàn)。從這些檢測方法建立并應(yīng)用于臨床以來,臨床和實(shí)驗(yàn)室的專家們就一直致力于實(shí)現(xiàn)測定方法和報(bào)告方式的規(guī)范化,迄今為止,只在PT應(yīng)用上取得了一定程度的進(jìn)展,也就是INR系統(tǒng)的建立；而APTT的標(biāo)準(zhǔn)化仍然停留在探索階段。由于凝血實(shí)驗(yàn)（特別是自動(dòng)化凝血檢驗(yàn)）起步較晚，反應(yīng)復(fù)雜，試劑存在較大差異性，造成了臨床應(yīng)用中缺乏標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范而出現(xiàn)了一些問題。本文就凝血實(shí)驗(yàn)中一些重要概念的定義以及適用性加以討論，以便在臨床工作中理解和運(yùn)用。 ?
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? ? 一、凝血參數(shù)檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性 ?
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? ? 與其他臨床化學(xué)檢驗(yàn)的方法學(xué)評估一樣，我們需要了解凝血實(shí)驗(yàn)測定的準(zhǔn)確度。就某種物質(zhì)的濃度或活性而言，一旦檢測方法確立，已知靶值時(shí)可以測定其準(zhǔn)確度。在凝血檢驗(yàn)中，由于凝集反應(yīng)（如PT）包含了諸多凝血因子的參與，其測定結(jié)果反映的并不是單一物質(zhì)的缺乏或增多，雖然其結(jié)果是定量指標(biāo)，但是這一指標(biāo)更多地反映了一系列凝集蛋白的相對活性。由于目前臨床應(yīng)用的PT和APTT測定試劑具有多樣性，而且凝血因子對于不同的試劑敏感性并不相同，因此即便是以手工方法用不同試劑測定同一份血漿標(biāo)本時(shí)，結(jié)果也不具有一致性。 ?
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? ? 凝血分析儀的出現(xiàn)不僅為批量處理標(biāo)本和簡化操作提供了可能，也給檢測的規(guī)范化帶來更大的困難，甚至可以說更加難以標(biāo)準(zhǔn)化。處于各方面因素的考慮，每個(gè)儀器制造商幾乎都使用不同的配套試劑。除了試劑不一致外，檢測原理也不盡相同，判定終點(diǎn)也不相同，由此得到“定量”結(jié)果—凝集時(shí)間也不相同。在這種情況下，沒有絕對的準(zhǔn)確而言。 ?
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? ? 即便是已經(jīng)得到廣泛研究和認(rèn)可的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR），也有多中心臨床試驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)室間存在著顯著差異。在使用同種試劑的情況下，不同儀器測定結(jié)果之間的差異是顯著的。原因之一就是在使用儀器的情況下凝血活酶的ISI定值不僅單純由試劑決定，還取決于凝血儀的類型，有些研究在默認(rèn)ISI適用于不同儀器的前提下研究儀器之間的可比性，造成了業(yè)內(nèi)對試劑校準(zhǔn)和系統(tǒng)校準(zhǔn)的混淆。 ?
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? ? 二、質(zhì)控血漿的賦值 ?
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? ? 在關(guān)于準(zhǔn)確度的臨床評估中，由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品可用，既往方案多使用質(zhì)控血漿當(dāng)作定值標(biāo)準(zhǔn)品，這種所謂的替代方法存在著嚴(yán)重錯(cuò)誤，長期以來為人詬病。首先質(zhì)控血漿不是標(biāo)準(zhǔn)品，用于質(zhì)量控制過程的物質(zhì)的最低要求包括兩點(diǎn)：（1）具有均一性，將質(zhì)控物的批內(nèi)差減到最小，才能更好地保證表現(xiàn)出來檢測體系的波動(dòng)；（2）具有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，在有效期內(nèi)質(zhì)控物的性能或濃度基本不變是質(zhì)量控制的前提。在此基礎(chǔ)上，可以提供質(zhì)控物某一指標(biāo)的測定范圍，也可以不予賦值。我們在臨床使用的質(zhì)控血漿絕大多數(shù)是賦值的，即標(biāo)識了某個(gè)測定范圍，因此有人就把質(zhì)控血漿的測定結(jié)果是否在此范圍內(nèi)作為考察準(zhǔn)確度的依據(jù)。應(yīng)該注意的是，凝血實(shí)驗(yàn)中除了Fbg定量以外的其他三個(gè)實(shí)驗(yàn)，都是“系統(tǒng)依賴性”測定，即檢驗(yàn)結(jié)果受到試劑的類型、批號、儀器及其狀態(tài)等多重因素的影響，任一因素發(fā)生變化都將使結(jié)果發(fā)生改變。比如，檢測系統(tǒng)類型、接觸活化因子以及試劑磷脂成份都會(huì)導(dǎo)致APTT反應(yīng)的差異性，直接產(chǎn)生結(jié)果波動(dòng)。日常質(zhì)控使用質(zhì)控血漿時(shí)，試劑已經(jīng)與廠家測定時(shí)不是一個(gè)批次了，這時(shí)血漿的賦值已不再適用。此外，如果質(zhì)控血漿賦值使用的機(jī)型和試劑種類、批號等都不明確，就使賦值區(qū)間更是形同虛設(shè)了。 ?
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? ? 其次，質(zhì)控血漿經(jīng)制造商測定后根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理提供的檢測范圍，至少包括了原檢測體系下全部測定值的4SD，如果說在這個(gè)區(qū)間內(nèi)都視為準(zhǔn)確顯然不妥。對于這個(gè)賦值范圍的理解，筆者認(rèn)為是供用戶在使用相同或相似檢測體系時(shí)選擇質(zhì)控目標(biāo)區(qū)間的一種參考，沒有任何靶值的提示或意義。 ?
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? ? 三、關(guān)于參數(shù)的定量及其參考范圍 ?
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? ? 如前所述，常規(guī)凝血檢驗(yàn)的四個(gè)項(xiàng)目中只有Fbg是可以定量的（Clauss法），Clauss法使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以溯源到國際標(biāo)準(zhǔn)品，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化, 而衍生法Fbg定量是根據(jù)血漿濁度變化來換算結(jié)果，不僅與真實(shí)濃度存在偏差而且也不能標(biāo)準(zhǔn)化。國內(nèi)銷售的Fbg定標(biāo)血漿多數(shù)經(jīng)過WHO參考血漿（如#98/612）校準(zhǔn)定值，但是用戶在使用時(shí)通常不注意試劑批號的變化，造成了實(shí)驗(yàn)室之間測定結(jié)果的差異。由于實(shí)驗(yàn)室很難直接使用國際標(biāo)準(zhǔn)品或參比血漿來校準(zhǔn)自己的工作曲線，批號造成的Fbg定量差異不易消除；同時(shí)由于Fbg測定試劑是單一凝血酶，每次又是過量使用，所以這種差異還不是很大。PT和APTT的情況則迥然不同，在試劑成份上二者都使用了不同類型的混合物，其中的不同成份對凝血因子的敏感性不同，從而導(dǎo)致使用不同品牌或批號的試劑時(shí)，結(jié)果出現(xiàn)較大差異，如果與不同原理的凝血儀搭配組合，其波動(dòng)幅度甚為可觀。筆者認(rèn)為，試劑的特殊性、檢測方法和終點(diǎn)判定的差異性從根本上決定了這些指標(biāo)應(yīng)用的特異性，也即不同檢測體系具有各自獨(dú)立的參考范圍。盡管這些指標(biāo)是定量的，其量值卻不具有溯源性，而且其參考范圍具有及時(shí)更新的必要性，當(dāng)儀器維護(hù)或校準(zhǔn)、試劑批號更換之后，有必要重新確定內(nèi)部參考范圍，這與血細(xì)胞計(jì)數(shù)的要求是完全不同的。?
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? ? 如此做法對于臨床實(shí)驗(yàn)室無論在成本消耗上，還是志愿者選擇上都有一定難度，而且頻繁變化的參考范圍不利于報(bào)告解釋。在實(shí)踐中我們不妨沿用正常對照的方法，比如，超出正常對照3秒以上視為PT異常，該對照可以是新鮮血，也可以是冷凍健康人血漿，在一定時(shí)限內(nèi)可以作為正常對照使用。 ?
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? ? INR作為PT標(biāo)準(zhǔn)化的一種嘗試日趨完善，在抗凝治療中其參考范圍已經(jīng)得到了成熟應(yīng)用，因此INR這一演算比值及其治療的預(yù)期范圍是應(yīng)該繼續(xù)沿用的。應(yīng)該注意的是，基于手工方法的INR報(bào)告方式推行以后，自動(dòng)化凝血儀逐步得到了廣泛使用。儀器測試原理與手工法顯著不同，對凝血活酶ISI以至INR產(chǎn)生較大的影響而且程度不確定，儀器的廣泛使用破壞了INR體系原有的可靠性和精密度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，同一廠家的相同機(jī)型對INR的影響都顯著不同，因此對儀器的校正就顯得十分必要。 ?
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? ? 我們必須明確：INR是WHO利用IRP標(biāo)定凝血活酶試劑后，手工測定PT時(shí)優(yōu)化報(bào)告的一種方法和理念。在此基礎(chǔ)上可以減少室間差異及提高報(bào)告的可比性，凝血活酶校準(zhǔn)時(shí)要求使用參考品和試管傾斜方法判定結(jié)果，然而，將商品化凝血活酶在自動(dòng)化凝血儀上檢測標(biāo)本時(shí)，原理發(fā)生了改變，這種校準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)已經(jīng)不復(fù)存在了。這時(shí)我們校準(zhǔn)的不再僅僅是凝血活酶，而是檢測系統(tǒng)—包括凝血活酶和檢測技術(shù)（儀器）的系統(tǒng)。此外，還要嚴(yán)格限定試劑標(biāo)識ISI的適用范圍。早期試劑的ISI都是針對手工法確定的，為了避免混亂，通過多年研究和專家的倡導(dǎo)，廠家已經(jīng)開始分別提供針對不同儀器型號的凝血活酶ISI，但是要測定不同儀器和試劑所有組合的各自ISI顯然是不可能的；有研究表明，制造商為每一批凝血活酶試劑提供的ISI不一定就是準(zhǔn)確的，定標(biāo)血漿的不當(dāng)使用將導(dǎo)致INR的校準(zhǔn)偏差；這使實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部校準(zhǔn)顯得尤為必要。 ?
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國外自動(dòng)化凝血分析儀發(fā)展的四十余年是個(gè)技術(shù)推陳出新、概念提出并不斷完善的過程，我國在短時(shí)間內(nèi)完成了設(shè)備的升級換代，而在基本概念和應(yīng)用中還有一些模糊甚至錯(cuò)誤的認(rèn)識和做法。總而言之，雖然凝血檢驗(yàn)的結(jié)果都是定量指標(biāo)，但是準(zhǔn)確度的概念由于試劑和方法等方面的因素至少在目前還不適于PT、APTT和TT的評價(jià)，同時(shí)這三個(gè)指標(biāo)也不適于建立或提出通行的參考范圍，必要時(shí)可參照正常對照標(biāo)本的測定值進(jìn)行結(jié)果解釋。INR的參考范圍僅適用于抗凝治療，而不能在凝血功能篩查時(shí)使用。質(zhì)控血漿作為評估系統(tǒng)穩(wěn)定性的均一物質(zhì)，其賦值區(qū)間不一定適用于實(shí)驗(yàn)室檢測體系，不能作為參考物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品使用。
