凝血實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化問題（二）
（二）凝血酶原時(shí)間（PT）的推薦方法
[原理]
將組織凝血活酶（主要含組織因子和脂質(zhì)）和鈣離子，加到枸櫞酸抗凝血漿中，在37℃保溫，測(cè)定血漿凝固時(shí)間，即為PT。PT主要用于篩選檢測(cè)外源凝血系統(tǒng)的因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ和相關(guān)因子的抑制物的試驗(yàn)。
[標(biāo)本來集和處理]
1.標(biāo)本采集：用硅化或塑料注射器抽取空腹靜脈血，按9:1比例加入含0.109mol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑的硅化或塑料試管中，輕輕混合均勻。
2.標(biāo)本處理：以2000～2500g，離心15分鐘，分離乏血小板血漿，并在24小時(shí)內(nèi)完成試驗(yàn)。
3.正常對(duì)照血漿：選擇正常健康男性和女性各lO名以上，年齡在18～45歲。但不能是妊娠、月經(jīng)期、哺乳期和口服避孕藥的婦女，采取的血漿冰凍干燥保存或-80℃保存。
[試劑]
1.抗凝劑：109mmol/L枸櫞酸鈉液（相當(dāng)于含二分子結(jié)晶水的枸櫞酸鈉32g/L）。
2.凝血活酶試劑：市售商品，應(yīng)標(biāo)有ISI、批號(hào)及有效期。凍干者應(yīng)按說明書加指定的緩沖稀釋劑復(fù)溶。
3.氯化鈣（CaCl2）溶液：為25mmol/L。（目前有些商品試劑已將凝血活酶液與氯化鈣液混合好，可不必另配CaCl2液）。
4.質(zhì)控物：正常及異常對(duì)照血漿
5.配制試劑用水必須符合1級(jí)純水的標(biāo)準(zhǔn)。
[儀器]
1.手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒溫水浴箱或電熱塊。水深能浸試管3cm以上，表面無劃痕的10×mm拭管。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的0.1mL移液管。經(jīng)校正的秒表。
2.儀器法：各種自動(dòng)或半自動(dòng)血凝儀，嚴(yán)格按說明書操作。
[操作步驟]
1.手工法
（1）測(cè)定溫度36.5～38.5℃，上述各試劑及被測(cè)血漿，均應(yīng)預(yù)溫至此一溫度，但凝血活酶試劑預(yù)溫不可超過30分鐘，血漿預(yù)溫一般不宜超過10分鐘。
（2）所用試管及加樣器等接觸血漿的器具均為塑料或硅化玻璃管。
（3）吸取枸櫞酸抗凝血漿0.1mL，加入一小試管中：加入凝血活酶試劑0.1mL混勻后置37℃水浴中。再加入25mmol/L
CaCl2液0.1mL，（也可先將凝血活酶試劑與CaCl2溶液等量混合，加入0.2mL）。立即混勻并開動(dòng)秒表：試管仍浸于水浴中，至約10秒鐘時(shí)，自水浴中取出，在紗布上迅速擦去試管外水滴，在明亮處不斷傾斜試管，在流動(dòng)狀態(tài)下觀察有無纖維蛋白形成。一旦見到纖維蛋白（同時(shí)將出現(xiàn)液體流動(dòng)減慢），立即停表，記錄時(shí)間。每次測(cè)定二管，按平均數(shù)報(bào)告。本試驗(yàn)的最后混合液其pH應(yīng)為7.2～7.3，大部分商品凝血活酶試劑均用含緩沖液的溶液配制。
（4）每批均同時(shí)做正常和異常對(duì)照，方法應(yīng)與測(cè)定標(biāo)本完全相同。
[報(bào)告方式]
1.以PT的秒（S）數(shù)報(bào)告（最接近的0.5秒）
2.以患者血漿（S）/正常對(duì)照PT（S）的比率（PRT）報(bào)告。
3.在口服華法令類抗凝藥物治療監(jiān)控時(shí)，應(yīng)報(bào)告國(guó)際正?；嚷剩↖NR）。大部分自動(dòng)化儀器可根據(jù)所測(cè)的PTR和凝血活酶試劑的ISI，自動(dòng)算出INR。手工法可根據(jù)下列公式，用一計(jì)算器直接計(jì)算：
Poller設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)便的列線圖，在取得PTR和ISI值后，即可從圖上直接查找出INR值，十分便利，國(guó)內(nèi)已有介紹。
ICSH規(guī)定，不再用稀釋曲線或百分比（活動(dòng)度）報(bào)告。
[參考值]
因儀器/試劑不同，會(huì)得出不同結(jié)果，故很難統(tǒng)一規(guī)定參考值。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的儀器、試劑等條件，自行測(cè)定一批健康人，建立參考值。此后至少每年或當(dāng)條件有變化時(shí)，根據(jù)新的條件，重新建立。參考值PT測(cè)定的一切條件均應(yīng)與患者血漿PT測(cè)定相同（包括采血、容器、抗凝劑等）。健康供血者應(yīng)選至少20個(gè)18～55歲的男性和非妊娠、月經(jīng)期女性，不可服藥，在平靜休息狀態(tài)采血、以減少個(gè)體差異（有條件時(shí)，可測(cè)一批老年人和小兒，分開統(tǒng)計(jì)）。同時(shí)應(yīng)分開幾天采血和測(cè)定，以減少天間差異。測(cè)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差：以兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（2SD）或95%可信限作為參考范圍。對(duì)于三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差是正常還是異常，需結(jié)合具體情況進(jìn)行評(píng)估。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講，其中有些人是正常的。用以上標(biāo)準(zhǔn)，病人（PT異常）則很少會(huì)遺漏。
三、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的標(biāo)準(zhǔn)化
（一）活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的標(biāo)準(zhǔn)化
APTT是檢測(cè)內(nèi)源凝血系統(tǒng)諸凝血因子缺陷和相關(guān)抑制物的篩選試驗(yàn)，也是當(dāng)前用于凝血因子、肝素抗凝治療以及狼瘡抗凝物質(zhì)檢測(cè)的主要手段。
與PT測(cè)定一樣，不同的部分凝血活酶、不同的活化劑和不同的激活時(shí)間對(duì)各種凝血因子缺陷、對(duì)肝素和對(duì)狼瘡抗凝物質(zhì)的敏感性相差很大。例如，檢測(cè)APTT的試劑中，所用活化劑（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他們對(duì)檢測(cè)肝素、狼瘡抗凝物質(zhì)和因子Ⅷ、Ⅸ的敏感性不同。
迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化或試劑標(biāo)準(zhǔn)化的可行方案問世，僅NCCLS于1992年，提出一個(gè)編號(hào)為H29-T的暫行方案。
（二）活化的部分凝血活酶時(shí)間（APTT）的推薦方法
[原理]
將一種磷脂和激活劑加到血漿中，經(jīng)過孵育后，加入適當(dāng)濃度的鈣離子。其纖維蛋白凝塊形成的時(shí)間（以秒計(jì)），即為APTT。本法主要用于過篩測(cè)定內(nèi)源途徑凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ、激肽釋放酶原（PK）、高分子量激肽原（HMWK）以及纖維蛋白原等。同時(shí)也用于上述因子的抑制物測(cè)定、肝素治療的監(jiān)測(cè)以及狼瘡抗凝因子的檢查。
[儀器]
本實(shí)驗(yàn)所用儀器、設(shè)備（包括采血、貯血容器、加樣裝置和標(biāo)本的處理等）以及對(duì)它們的要求完全與PT相同。PT所用自動(dòng)化儀器同樣適于本實(shí)驗(yàn)。
[試劑]
1.部分凝血活酶試劑：由商品供應(yīng)。一般已與檄活劑按比例配在一起（或分開配制）常用的激活劑由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活劑，由廠方配套供應(yīng)。
APTT試劑/儀器結(jié)合，應(yīng)能使因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性低于0.3μ/mL（或＜30%）的血漿，出現(xiàn)異常延長(zhǎng)的結(jié)果。
2.氯化鈣溶液（25mmol/L）以及其它試劑與PT所用者相同。
[操作步驟]
1.樣品的采取、貯存、輸送與PT測(cè)定相同。注意，應(yīng)用清潔的塑料或硅化玻璃采血器采血及貯血。
2.標(biāo)本（去血小板的血漿）的制備與PT相同。注意、應(yīng)用去血小板血漿測(cè)定。
3.水浴箱或電熱板的溫度為37℃±1℃，要經(jīng)常檢查是否正確。
4.接觸活化時(shí)間：加激活劑活化因子Ⅻ的時(shí)間要保持一致；各儀器和試劑生產(chǎn)廠家的規(guī)定可能不一樣，應(yīng)嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。手工操作時(shí)，應(yīng)用秒表或類似的定時(shí)裝置計(jì)時(shí)。
5.操作：預(yù)溫（不超過30分鐘）APTT試劑一份與預(yù)溫（不超過10分鐘）的侍測(cè)血漿一份混合，立即開動(dòng)秒表計(jì)時(shí)；至規(guī)定的接觸活化時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，加人預(yù)溫37℃的CaCl2液一份，混勻，同時(shí)開動(dòng)秒表。至出現(xiàn)血漿凝固時(shí)，停表，記錄血漿凝固時(shí)間（以秒計(jì)）。手工測(cè)定時(shí)應(yīng)同時(shí)測(cè)定兩管，按平均數(shù)報(bào)告。一些精密度已有很大改進(jìn)的自動(dòng)或半自動(dòng)凝血儀，如果有適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)也可只測(cè)定一次。應(yīng)同時(shí)測(cè)定正常和異常對(duì)照血漿。
[參考值]參照PT
[特殊解釋]
1.對(duì)肝素的敏感性：APTT常用于肝素治療的監(jiān)測(cè)，通常以患者APTT與正常血漿APTT的比率在1.5～2.5作為治療控制范圍：但不同的試劑/儀器系統(tǒng)對(duì)肝素的敏感性不同。其試劑/儀器系統(tǒng)對(duì)肝素的敏感性可進(jìn)行測(cè)定。體外的敏感性（in
vitro sensitlvity）是指將臨床在使用的同類型釣肝素按其治療濃度，加到正常血漿中，測(cè)定APTT。體外敏感性與體內(nèi)敏感性（in
vivo sensitivity）不等同，但可作參考。
2.浪瘡抗凝因子：狼瘡抗凝因子是一種抗磷脂的自身抗體，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干擾凝血。血中如存在狼瘡抗凝因子，APTT將延長(zhǎng)。但APTT試劑對(duì)狼瘡抗疑因子的敏感性有很大差別，試劑制造廠家應(yīng)提供足夠的說明，有關(guān)的國(guó)家機(jī)構(gòu)也可提供對(duì)狼瘡抗凝因子的資抖。但要知道，病人個(gè)體之間也有很大差異，沒有一種試劑能測(cè)出所有狼瘡抗凝因子。
四、纖維蛋白原測(cè)定（Fg）的標(biāo)準(zhǔn)化
（一）纖維蛋白原測(cè)定（Fg）的標(biāo)準(zhǔn)化問題
纖維蛋白原（死）由肝合成，存在于血漿和體液中，其結(jié)構(gòu)和功能基本已搞清，但迄今仍無理想的臨床檢測(cè)方法；文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法多至10余種，有的精密度、準(zhǔn)確信較好，但過于復(fù)雜、煩瑣；有的雖然簡(jiǎn)便、快速，但精密度、準(zhǔn)確性較差。
1992年，英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)及控制研究所（NIBSC）、研究完成了一個(gè)纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)為89/644，向WHO的生物標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)（ECBS）推薦，[15]并被ECBC批準(zhǔn)為國(guó)際參考品（IRP）。從此，各國(guó)均引進(jìn)這一標(biāo)準(zhǔn)品來標(biāo)化本國(guó)或廠家生產(chǎn)的次極標(biāo)準(zhǔn)品（我國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心亦已在引進(jìn)）。使纖維蛋白原測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作，走出了關(guān)鍵的一步。因此根據(jù)調(diào)查，各家標(biāo)準(zhǔn)品纖維蛋白原含量差別很大。
（二）纖維蛋白原（Fg）測(cè)定的推薦方法
各家用IRP來標(biāo)化自己的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，推薦采用Jacobsson的改良法，現(xiàn)將該法介紹如下。
[試劑]
1.緩沖液：Na2O·2H2O 0.882g；KH2PO4 2.77gl升，此為貯存緩沖液；將貯存緩沖液l份，加生理鹽水2份即為應(yīng)用緩沖液，pH為6.35。
2.生理鹽水：0.15mol/L
3.人或牛凝血酶：500IU/mL，生理鹽水溶液。
4.凝塊溶解劑：尿素400g溶于少量蒸溜水中，200mL 1.Omol/L NaOH，再加水至l升。
[操作步驟]
將纖維蛋白原凍干（標(biāo)準(zhǔn)）品（源于89/644）加lmL蒸餾水復(fù)溶，加到含有2mL應(yīng)用緩沖液的有機(jī)玻璃淺盤或其他容器中，再加入凝血酶液50μL，迅速混勻，在室溫中靜制置2小時(shí)。將容器倒扣于吸水的布上（其下可墊吸水紙），再用適當(dāng)物質(zhì)（加濾紙）將凝塊吸干。將凝塊取下，置于5OmL生理鹽水中洗滌2次，每次洗滌后均應(yīng)將凝塊吸干（可用玻璃擠壓凝塊），盡量除去含于凝塊中的液體，以免液體中的其它血漿蛋白殘留。必要時(shí)可在清潔棉布上擠壓。
小心將凝塊加人含凝塊溶解劑7.5mL的容器中，搖勻，直至凝塊完全溶解。倒人光徑為1cm的比色杯中，以凝塊溶解劑為空白，在280nm和315nm波長(zhǎng)讀取吸光度（A）。
[計(jì)算]
纖維蛋白原濃度（g/L）
式中15.87為纖維蛋白在堿性條件下波長(zhǎng)280nm的消光系數(shù)；7.5為纖維蛋白原的稀釋倍數(shù)。
當(dāng)A在1.0以下時(shí)，吸光度與濃度呈線性關(guān)系。如A大于1.0，應(yīng)稀釋標(biāo)本重新測(cè)定，重新乘稀釋倍數(shù)
（三）適用的纖維蛋白原（Fg）測(cè)定（Clauss法）
[原理]
將凝血酶加到血漿中，使纖維蛋白原變成纖維蛋白，血漿便出現(xiàn)凝固。在有足量的凝血酶時(shí)，與不同含量的纖維蛋白原作用，其出現(xiàn)血漿凝固的時(shí)間與纖維蛋白原含量呈負(fù)相關(guān)。
[試劑]
1.牛凝血酶l00NIHU/mL
2.纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品（IRP次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）
3.緩沖液（下列兩種任選一種）：
（1）巴比妥緩沖液（PH7.5）；巴比妥2.5g，巴比妥鈉2.75g，璐氯化鈉7.3g溶于750mL去離子水中，校正至PH7.5，加水至1L。
（2）咪唑（Imidazole，或Glyoxaline）緩沖液：咪唑3.4g（0.05mol/L），氯化鈉5.85g，加于約500mL水中；加O.1mol/L鹽酸186mL，調(diào)PH至7.3-7.4，最后加蒸餾水至1升。
[操作步驟]
1.手工法
（1）用上述緩沖液先將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.8，1.6，2.4，和4.0g/L纖維蛋白原濃度，各濃度再用緩沖液作1:10稀釋。
（2）患者血漿及質(zhì)控物用緩沖液作1:10稀釋。
（3）將含100NIHU/mL，牛凝血酶，混勻后室溫保存。如用儀器法測(cè)定，則用100NIHU/mL，牛凝血酶，不必稀釋。
（4）在一試管中，加稀釋血漿0.2mL，置37℃水浴中4分鐘。
（5）加入預(yù)溫37℃的lOONIHU/mL凝血酶液O.2mL，搖勻并立即開動(dòng)秒表，不斷觀察凝固時(shí)間。至出現(xiàn)凝固時(shí)停表。
（6）每份標(biāo)本測(cè)定兩次，求平均數(shù)。同時(shí)測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)管和對(duì)照（質(zhì)控）管，方法相同，準(zhǔn)確記錄時(shí)間。
（7）計(jì)算：用雙對(duì)數(shù)紙作圖，以凝固時(shí)間為縱坐際、纖維蛋白原濃度為橫坐標(biāo)，將各相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)凝固時(shí)間，在圖上標(biāo)出相應(yīng)的點(diǎn)并連成直線，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)患者和質(zhì)控血漿所測(cè)得的凝固時(shí)間。在圖上查到纖維蛋白原含量。
如血漿纖維蛋白原含量大于4g/L，應(yīng)稀釋血漿后重測(cè)，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如血漿纖維蛋白原含量低于O.8g/L，需將原血漿改為1:2或1:5稀釋，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得結(jié)果后除以5或除以2。
2.儀器法：本法可用自動(dòng)或半自動(dòng)凝血儀按凝血酶時(shí)間（TT）測(cè)定法測(cè)定?？勺詣?dòng)打印出結(jié)果。一般儀器法比手工法精密度高.
